タンパク質のユビキチン化の検出
Summary
ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明<em> in vivoで</em>と試験管<em> in vitroで</em>。
Abstract
ユビキチン化、タンパク質を標的とするペプチドユビキチンの共有結合は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。彼らは、ユビキチン活性化酵素E1、ユビキチン結合酵素E2、およびユビキチンリガーゼE3が含まれています。 E1とE2のとは違って、E3ユビキチンリガーゼの基質特異性を表示します。一方、多数のdeubiquitylating酵素はポリユビキチン化タンパク質を処理するの役割を担っている。ユビキチンは、タンパク質の安定性、細胞内局在、及び生物学的活性の変化をもたらすことができる。ユビキチン化/脱ユビキチン化経路または変更されたユビキチンシステムの機能に関与する遺伝子の変異は、癌、神経変性、および代謝性疾患の様々なタイプなど、さまざまなヒト疾患に関連付けられています。標的タンパク質の改変されたか、通常のユビキチン化の検出は、これらの疾患の病因に関するより良い理解を提供することがあります。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明<em> in vivoで</em>と試験管<em> in vitroで</em>。これらのプロトコルはまた、sumolyationとneddylationなどの他のユビキチン様小分子の改変を検出するのに有用です。
Protocol
Discussion
このプレゼンテーションでは、まず、培養哺乳動物細胞で目的のタンパク質にユビキチン修飾を検出可能にする手順を説明した。特に興味の蛋白質ではなく、非共有結合的に相互作用するタンパク質のユビキチン化を検出するために、我々は、細胞溶解、免疫沈降および1,3を洗浄するための厳しい条件を使用していました。抗ユビキチンブロッティングが続くような過酷な条件で標?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
再生医療助成RS1 – 00331から1のためのカリフォルニア工科大学とRL1 – 00682から1（Z.チャンへ）;アメリカのパーキンソンこの作品は、NIHの助成金RO1 DC006497、RO1 NS057289、及びPO1 ES016738（Z.チャンへ）によってサポートされていました疾患協会（Z. ZhangとYSチューチューへ）、およびパーキンソン病研究のためのマイケルJフォックス財団（Z.チャン）。
References
- Xiong, H. PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation. J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).
- Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity. Cell. 118, 83-97 (2004).
- Didier, C. RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization. Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).
- Laney, J. D., Hochsetrasser, M. Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination. Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).
