Een kwantitatieve beoordeling van de gist Lipidome met behulp van electrospray ionisatie massaspectrometrie

Summary

Beschrijven we een nieuwe kwantitatieve lipidomics methode voor het identificeren van een groot aantal soorten lipiden in gist met behulp van survey-scan electrospray ionisatie massa spectrometrie (ESI / MS). Deze methode dan op dit moment beschikbare methoden voor lipide identificatie en kwantificering in de mogelijkheid om verschillende moleculaire vormen van lipiden, gevoeligheid en snelheid op te lossen.

Abstract

Lipiden zijn een van de belangrijkste klassen van biomoleculen en spelen een belangrijke rol membraan dynamiek, energie-opslag, en signalering^1-4. De gist<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Een genetisch en biochemisch manipuleerbare eencellige eukaryote met geannoteerde genoom en zeer eenvoudig lipidome, is een waardevol model voor het bestuderen van biologische functies van de verschillende soorten lipiden in meercellige eukaryoten^2,3,5.<em> S. cerevisiae</em> Heeft 10 grote klassen van lipiden met een ketenlengte voornamelijk uit 16 of 18 koolstofatomen en een nul of een graad van onverzadiging^6,7. Bestaande methoden voor lipide identificatie en kwantificatie – zoals hoge prestatie vloeistof chromatografie, dunnelaagchromatografie, fluorescentie microscopie, en gas chromatografie gevolgd door MS – zijn goed ingeburgerd, maar hebben een lage gevoeligheid, onvoldoende afzonderlijk verschillende moleculaire vormen van lipiden, voordat nodig lipide derivitization voor analyse, of kan heel tijdrovend zijn. Hier presenteren wij een uitgebreide beschrijving van onze experimentele benadering van deze inherente beperkingen op te lossen door gebruik te maken survey-scan ESI / MS voor de identificatie en kwantificatie van de totale aanvulling van lipiden in gistcellen. De beschreven methode vereist geen chromatografische scheiding van complexe mengsels lipide hersteld van gistcellen, waardoor veel van het proces van data-acquisitie versnellen. Deze methode maakt lipide identificatie en kwantificatie van de concentraties zo laag als g / ml en is met succes toegepast voor het beoordelen van lipidomes van hele gist cellen en hun organellen gezuiverd. Lipiden-extractie van de hele gistcellen voor het gebruik van deze methode van lipide analyse duurt twee tot drie uur. Het duurt slechts vijf tot tien minuten aan elk monster van geëxtraheerd en gedroogd lipiden draaien op een Q-TOF massaspectrometer uitgerust met een nano-electrospray bron.

Protocol

Materialen en methoden Giststammen en groei-omstandigheden De wild-type stam BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) werd gekweekt in een rijke YEPD medium (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose). Cellen werden gekweekt bij 30 ° C met een rotatie schudden bij 200 rpm in erlenmeyers op een 'fles volume / medium volume "ratio van 5:1. Opslag van gistcellen voor vetextractie Een 50 ml cultuur van cellen werd geoogst door centrifugeren bij 3000 xg gedurend…

Discussion

Deze methode maakt een snelle kwantitatieve beoordeling van de gist lipidome met behulp van direct beschikbaar, goedkope materialen. De methode maakt de identificatie van de meeste lipide soorten die in gistcellen, met uitzondering van diacylglycerolen, ergosterolen en ergosteryl esters, hoewel deze lipiden kunnen worden geïdentificeerd door het vervangen van ammonium hydroxide met lithium hydroxide. De beschreven methode kunnen lipide identificatie en kwantificatie van de concentraties zo laag als ug / ml, met de conc…