Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray

Summary

Se describe un nuevo método cuantitativo para la identificación de lipidómica numerosas especies de lípidos en la levadura con la encuesta de exploración de ionización electrospray espectrometría de masas (ESI / MS). Este método supera actualmente los métodos disponibles para la identificación y cuantificación de los lípidos en la capacidad de resolver diferentes formas moleculares de los lípidos, la sensibilidad y la velocidad.

Abstract

Los lípidos son una de las principales clases de biomoléculas y desempeñan funciones importantes en la dinámica de la membrana, el almacenamiento de energía, y la señalización^4.1. La levadura en ciernes<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Una genéticamente y bioquímicamente eucariotas unicelulares manipulable con genoma anotado lipidome y muy simple, es un valioso modelo para el estudio de las funciones biológicas de las especies de lípidos en diversos eucariotas multicelulares^2,3,5.<em> S. cerevisiae</em> Cuenta con 10 principales clases de lípidos con longitudes de cadena, principalmente de 16 o 18 átomos de carbono y cero o un grado de insaturación^6,7. Los métodos existentes para la identificación y cuantificación de los lípidos – tales como la cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía en capa fina, la microscopía de fluorescencia, y la cromatografía de gases seguida por los Estados miembros – están bien establecidos, pero tienen una baja sensibilidad, no lo suficientemente separadas las diversas formas moleculares de los lípidos, requieren derivatización lípidos antes para el análisis, o puede ser bastante lento. Aquí se presenta una descripción detallada de nuestro enfoque experimental para resolver estas limitaciones inherentes al uso de la encuesta de exploración ESI / MS para la identificación y cuantificación de la dotación completa de los lípidos en las células de levadura. El método descrito no requiere la separación cromatográfica de mezclas de lípidos complejos se recuperó de las células de levadura, por lo tanto acelerar considerablemente el proceso de adquisición de datos. Este método permite la identificación y cuantificación de los lípidos en las concentraciones tan bajas como g / ml y se ha aplicado con éxito para evaluar lipidomes de células de levadura entero y sus orgánulos purificada. Extracción de los lípidos de las células de levadura todo para el uso de este método de análisis de los lípidos lleva de dos a tres horas. Se tarda sólo cinco a diez minutos para ejecutar cada muestra de los lípidos extraídos y desecados en un espectrómetro de masa Q-TOF equipado con una fuente nano-electrospray.

Protocol

Materiales y métodos Cepas de levadura y las condiciones de crecimiento La cepa de tipo salvaje BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) fue cultivada en medio rico en YEPD (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa). Las células fueron cultivadas a 30 ° C con rotación agitación a 200 rpm en frascos de Erlenmeyer en un "frasco de volumen / volumen medio de" proporción de 5:1. Almacenamiento de las células de levadura para la extracción de lípidos …

Discussion

Este método permite una rápida evaluación cuantitativa de la lipidome levadura utilizando fácilmente disponibles, materiales de bajo costo. El método permite la identificación de la mayoría de las especies de lípidos en las células de levadura con la excepción de diacilgliceroles, ergosterols y ésteres ergosteryl, a pesar de estos lípidos pueden ser identificados mediante la sustitución de hidróxido de amonio con hidróxido de litio. El método descrito permite la identificación y cuantificación de los l…