Eine quantitative Bewertung der Hefe Lipidome mit Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie
Summary
Wir beschreiben eine neue quantitative Lipidomik Methode zur Identifizierung zahlreicher Lipidspezies in Hefe mit Umfrage-scan Elektrospray Massenspektrometrie (ESI / MS). Diese Methode überschreitet derzeit verfügbaren Methoden für die Lipid-Identifizierung und Quantifizierung in der Fähigkeit, verschiedene molekulare Formen von Lipiden, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit zu lösen.
Abstract
Lipide sind eine der wichtigsten Klassen von Biomolekülen und spielen eine wichtige Rolle Membran Dynamik, Energiespeicherung und-Signalisierung<sup> 1-4</sup>. Die Bierhefe<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Ist eine genetisch und biochemisch manipulierbar einzelligen Eukaryoten mit annotierten Genom und sehr einfach lipidome, ein wertvolles Modell für die Untersuchung biologischer Funktionen der verschiedenen Lipid-Spezies in mehrzelligen Eukaryoten<sup> 2,3,5</sup>.<em> S. cerevisiae</em> Verfügt über 10 große Klassen von Lipiden mit Kettenlängen hauptsächlich von 16 oder 18 Kohlenstoffatomen und entweder Null oder Eins Unsättigungsgrad<sup> 6,7</sup>. Bestehende Verfahren zur Lipid-Identifizierung und Quantifizierung – wie Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Fluoreszenzmikroskopie, und Gaschromatographie mit MS gefolgt – gut etabliert sind, aber eine geringe Empfindlichkeit, unzureichend getrennte verschiedenen molekularen Formen von Lipiden, benötigen Lipid Derivatisierung vor zur Analyse, oder kann sehr zeitaufwendig sein. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung unserer experimentellen Ansatz, um diese inhärenten Einschränkungen durch Umfrage-scan ESI / MS zur Identifizierung und Quantifizierung des gesamten Ergänzung von Lipiden in Hefezellen zu lösen. Das beschriebene Verfahren erfordert keine chromatographische Trennung von komplexen Lipid-Mischungen aus Hefezellen gewonnen und damit erheblich beschleunigt den Prozess der Datenerfassung. Diese Methode ermöglicht Lipid Identifizierung und Quantifizierung der Konzentrationen so niedrig wie g / ml und wurde erfolgreich zur Beurteilung lipidomes der ganzen Hefezellen und ihre Organellen gereinigt angewendet. Lipids Extraktion aus ganzen Hefezellen für die Verwendung dieser Methode der Lipid-Analyse dauert zwei vor drei Stunden. Es dauert nur fünf Minuten vor zehn Minuten, um jede Probe extrahiert und getrocknet Lipide auf einem Q-TOF-Massenspektrometer mit einer Nano-Elektrospray-Quelle ausgestattet laufen.
Protocol
Discussion
Diese Methode ermöglicht eine schnelle quantitative Beurteilung der Hefe lipidome mit leicht verfügbaren, preiswerten Materialien. Die Methode erlaubt die Identifikation der meisten Lipidspezies in Hefezellen mit Ausnahme der Diacylglycerole, ergosterols und ergosteryl Ester gefunden, obwohl diese Lipide durch den Austausch Ammoniumhydroxid mit Lithiumhydroxid identifiziert werden kann. Das beschriebene Verfahren ermöglicht Lipid Identifizierung und Quantifizierung der Konzentrationen so niedrig wie pg / ml, wobei di…
Acknowledgements
Wir sind dankbar, dass Alain Tessier für wertvolle Beratung, Diskussionen und technische Unterstützung. Wir erkennen das Zentrum für Biologische Anwendungen der Massenspektrometrie an der Concordia University für herausragende Leistungen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem CIHR und der NSERC of Canada unterstützt. VIT ist ein CIHR New Investigator und Concordia University Research Chair in Genomics, Cell Biology and Aging.
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