L'isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris
Summary
La capacité des cellules embryonnaires germinales à se différencier en cellules germinales primordiales durant les stades de développement précoce est un modèle parfait pour répondre à nos hypothèses sur le cancer et l'infertilité. Ce protocole montre comment isoler des cellules germinales primordiales gonades en développement en 10/05 à 11/05 jours post coïtum embryons de souris.
Abstract
La capacité des cellules embryonnaires germinales (EG) de se différencier en cellules germinales primordiales (PGC) et plus tard en gamètes premiers stades de développement est un modèle parfait pour répondre à nos hypothèses sur le cancer et l'infertilité. Ce protocole montre comment isoler des cellules germinales primordiales gonades en développement dans les embryons 10/05 au 11/05 jours post-coïtum souris (DPC). Développer les crêtes gonadiques d'embryons de souris (C57BL6J) ont été dissociées par une rupture mécanique avec de la collagénase, puis étalées en une couche de fibroblastes d'embryon de souris d'alimentation (MEF-CF1) qui était auparavant mitotiquement inactivé par la mitomycine C, en présence des médias à élimination directe et complétée par un inhibiteur de la leucémie Cell Factor Factor (LIF), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF), et souches (SCF). L'utilisation de ces méthodes optimisées pour l'identification PCG, l'isolement, et l'établissement de conditions de culture permet les cultures à long terme des cellules EG depuis plus de 40 jours. Les lignes de cellules embryonnaires germinales montré phénotype embryonnaire et l'expression des marqueurs utilisés commune de l'état pluripotent. L'isolement et la dérivation de cellules germinales dans la culture de fournir un outil pour comprendre leur développement in vitro et offrent la possibilité de surveiller les dommages cumulatifs aux niveaux génétiques et épigénétiques après l'exposition au stress oxydatif.
Protocol
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner l'aide inestimable de: Dr Neal First et Kourtney Wilkinson pour le manuscrit d'édition, le Dr Lucy Senter, le Dr Brigitte Willeford et Mike Basett de l'aide pour les soins de formation et d'animaux à l'installation MSU ALAC souris accrédités; Dr Dwayne Wise pour son aide à la microscopie et la capture d'image; Cesar Monroy, Hannah Swoope, et Bobbie Huddleston pour leur aide à la production vidéo à la MSU. Cette recherche a été financée par l'Office de la recherche institutionnelle et le Département des sciences biologiques à la Mississippi State University.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | ||||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | ||
| Collagenase /Dispase Solution | Roche | 269638 | ||
| Gelatin | Sigma | G1890 | ||
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | ||
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | ||
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | ||
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | ||
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | ||
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | ||
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522 | ||
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | ||
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 | |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | |||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | ||
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
References
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