Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi
Summary
Ilkel germinal hücrelerin ayırt etmek için erken geliştirme aşamasında, embriyonik germinal hücreler, kanser ve kısırlık hakkındaki hipotezi adresine yeteneği mükemmel bir model. Bu protokol, 10,5-11,5 gün coitum fare embriyoları, gelişmekte olan gonadlar ilkel germinal hücreleri izole etmek için nasıl gösterir.
Abstract
Embriyonik germinal hücrelerin yeteneği (EG), kanser ve kısırlık hakkındaki hipotezi adresi için mükemmel bir model, erken gelişim aşamalarında, ilkel germinal hücreleri (PGCs) içine ve daha sonra gamet içine ayırt etmek için. Bu protokol, 10,5-11,5 gün coitum (DPC) fare embriyoları, gelişmekte olan gonadlar ilkel germinal hücreleri izole etmek için nasıl gösterir. Fare embriyoları gonadal sırtlar Geliştirme (C57BL6J) sonra daha önce mitotik nakavt medya huzurunda mitomisin C ile inaktive edilmiş ve Lösemi İnhibitörü ile desteklenmiş bir fare embriyo fibroblast besleyici tabaka (MEF-CF1) kaplama kollajenaz ile mekanik parçalanması, ayrışmış edildi Faktörü (LIF), temel Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF) ve Kök Hücre Faktörü (SCF). PCG kimlik, kültür koşulları, izolasyon, ve kurulması için optimize edilmiş, bu yöntemleri kullanarak, en fazla 40 gün için EG hücreleri uzun vadeli kültürleri izin verir. Embriyonik germinal hücre hatları, pluripotent devletin yaygın olarak kullanılan belirteçlerin embriyonik fenotip ve ifade gösterdi. İzolasyon ve kültür germinal hücrelerin türetme gelişimini anlamak ve in vitro genetik ve epigenetik düzeyde oksidatif strese maruz kaldıktan sonra birikimli hasar izlemek için bir fırsat sunmak için bir araç sağlar.
Protocol
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Lucy Senter, Dr. Brigit Willeford ve MSU ALAC akredite fare tesisi, eğitim ve hayvan bakımı ile ilgili yardım için Mike Basett; Dr. Dwayne Wise Dr Neal Birinci ve yazının düzenleme için Kourtney Wilkinson: Yazarlar, paha biçilmez bir yardım kabul etmek istiyorum Cesar Monroy Hannah Swoope ve Bobbie Huddleston MSU video üretimi ile yardım için mikroskopi ve görüntü yakalama ile yaptığı yardım için. Bu araştırma, Mississippi State Üniversitesi Kurumsal Araştırma ve Biyolojik Bilimler Bölümü Ofisi tarafından finanse edildi.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | ||||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | ||
| Collagenase /Dispase Solution | Roche | 269638 | ||
| Gelatin | Sigma | G1890 | ||
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | ||
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | ||
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | ||
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | ||
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | ||
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | ||
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522 | ||
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | ||
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 | |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | |||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | ||
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
References
- DeFelici, M. . Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M., Sharp, P. T., Mason, I. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. Molecular embryology: methods and protocols. 97, (1999).
- Mc Laren, A., Southee, D. Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis. Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).
- Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification. Development. 128, 481-490 (2001).
- Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs. J Vis Exp. , (2008).
