Выделение и Вывод мышиных эмбриональных зародышевых клеток
Summary
Способность эмбриональных зародышевых клеток дифференцироваться в первичных зародышевых клеток на ранних стадиях развития является идеальной моделью для решения нашу гипотезу о раке и бесплодие. Этот протокол показывает, как изолировать первичный зародышевых клеток из развивающихся гонад в 10.5-11.5 дней после эмбрионов coitum мыши.
Abstract
Способность эмбриональных зародышевых клеток (EG) дифференцироваться в первичных зародышевых клеток (PGCs), а затем в гаметы во время ранних стадиях развития является идеальной моделью для решения нашу гипотезу о раке и бесплодие. Этот протокол показывает, как изолировать первичный зародышевых клеток из развивающихся гонад в 10.5-11.5 дней после coitum (ЦОД) эмбрионов мыши. Разработка половых хребты из мышиных эмбрионов (C57BL6J) были диссоциированы механическое разрушение с коллагеназа, а затем помещают в фибробласты эмбриона мыши фидерного слоя (MEF-CF1), который был ранее митотически инактивированные митомицином С в присутствии средств массовой информации нокаутом и дополнены лейкемии Ингибитор фактор (LIF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), и фактор стволовых клеток (SCF). Используя эти методы оптимизированы для PCG выявление, изоляцию, а также создание условий культивирования позволяет долгосрочных культурах Е. клетки в течение более 40 дней. Эмбриональных зародышевых линий эмбриональных клеток показали, фенотип и выражение общих использовать маркеры плюрипотентных государства. Выделение и вывод зародышевых клеток в культуре предоставить инструмент, чтобы понять их развитие в лабораторных и предлагают возможность контролировать совокупный ущерб на генетические и эпигенетические уровни после воздействия окислительного стресса.
Protocol
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить неоценимую помощь: д-р Нил Первый и Кортни Уилкинсон для редактирования рукописей, д-р Люси Senter, доктор Бриджит Willeford и Майк Basett за помощь в подготовке и ухода за животными в МГУ ALAC аккредитованных объекта мышь; доктор Дуэйн Мудрого за помощь в микроскопии и захват изображения; Сезар Монрой, Ханна Свуп, и Бобби Хаддлстон за их помощь в видео-продукции в МГУ. Это исследование было профинансировано Управлением институциональных исследований и Отделение биологических наук Университета штата Миссисипи.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | ||||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | ||
| Collagenase /Dispase Solution | Roche | 269638 | ||
| Gelatin | Sigma | G1890 | ||
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | ||
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | ||
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | ||
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | ||
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | ||
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | ||
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522 | ||
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | ||
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 | |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | |||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | ||
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
References
- DeFelici, M. . Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M., Sharp, P. T., Mason, I. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. Molecular embryology: methods and protocols. 97, (1999).
- Mc Laren, A., Southee, D. Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis. Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).
- Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification. Development. 128, 481-490 (2001).
- Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs. J Vis Exp. , (2008).
