अलगाव और माउस भ्रूणीय कीटाणु कक्ष की व्युत्पत्ति
Summary
भ्रूण कीटाणु कोशिकाओं के प्रारंभिक विकास चरणों के दौरान मौलिक कीटाणु कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता के लिए एक आदर्श कैंसर और बांझपन के बारे में हमारी परिकल्पना पता मॉडल है. इस प्रोटोकॉल पता चलता है कि कैसे 10.5-11.5 दिनों के बाद coitum माउस भ्रूण में विकासशील gonads से मौलिक कीटाणु कोशिकाओं को अलग करने के लिए.
Abstract
भ्रूण कीटाणु कोशिकाओं की क्षमता (जैसे) के प्रारंभिक विकास चरणों के दौरान मौलिक कीटाणु कोशिकाओं (PGCs) में और बाद में gametes में अंतर करने के लिए एक आदर्श कैंसर और बांझपन के बारे में हमारी परिकल्पना पता मॉडल है. इस प्रोटोकॉल पता चलता है कि कैसे 10.5-11.5 दिनों के बाद coitum (डीपीसी) माउस भ्रूण में विकासशील gonads से मौलिक कीटाणु कोशिकाओं को अलग करने के लिए. माउस भ्रूण से gonadal लकीरें का विकास (C57BL6J) collagenase के साथ यांत्रिक विघटन, तो एक माउस भ्रूण fibroblast फीडर (MEF – CF1) परत है कि पहले mitotically mitomycin सी के साथ पीटा मीडिया की उपस्थिति में निष्क्रिय और लेकिमिया अवरोध करनेवाला के साथ पूरक में चढ़ाया द्वारा अलग थे (LIF) फैक्टर, बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF), और स्टेम सेल फैक्टर (SCF). PCG पहचान, अलगाव, संस्कृति शर्तों के और स्थापना के लिए इन अनुकूलित विधियों का प्रयोग अधिक से अधिक 40 दिनों के लिए ईजी कोशिकाओं के दीर्घकालिक संस्कृतियों परमिट. भ्रूण कीटाणु सेल लाइनों भ्रूण और pluripotent राज्य के आम उपयोग मार्करों के phenotype अभिव्यक्ति दिखाया. अलगाव और संस्कृति में कीटाणु कोशिकाओं की व्युत्पत्ति एक उपकरण के लिए इन विट्रो में उनके विकास को समझने और आनुवंशिक और epigenetic स्तर पर oxidative तनाव के प्रदर्शन के बाद संचयी नुकसान की निगरानी करने का अवसर प्रदान करते हैं प्रदान करते हैं.
Protocol
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
, डॉ. लुसी Senter, डा. ब्रिजिट Willeford और MSU ALAC मान्यता प्राप्त माउस सुविधा प्रशिक्षण और जानवरों की देखभाल के साथ सहायता के लिए माइक Basett, डॉ. ड्वेन समझदार डॉ. नील पहले और पांडुलिपि संपादन के लिए Kourtney विल्किनसन: लेखकों के अमूल्य मदद स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं Cesar Monroy, हन्ना Swoope, और MSU में वीडियो उत्पादन के साथ उनकी सहायता के लिए Bobbie हडलस्टन, माइक्रोस्कोपी और छवि पर कब्जा के साथ उसकी सहायता के लिए. इस शोध संस्थागत अनुसंधान और मिसिसिपी राज्य विश्वविद्यालय में जीव विज्ञान विभाग के कार्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | ||||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | ||
| Collagenase /Dispase Solution | Roche | 269638 | ||
| Gelatin | Sigma | G1890 | ||
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | ||
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | ||
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | ||
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | ||
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | ||
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | ||
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522 | ||
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | ||
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 | |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | |||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | ||
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
References
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