Genetische studies van het menselijk DNA Repair eiwitten met behulp van gist als een model-systeem
Summary
Genetische studies in gist kan worden gebruikt om de moleculaire en cellulaire functies van de menselijke genen te onderzoeken in de cellulaire DNA metabolisme. Methoden beschreven voor de genetische karakterisering van het menselijk<em> WRN</em> Genproduct defect in de vroegtijdige veroudering aandoening Werner syndroom in functioneel geconserveerd paden met behulp van gist als een soepel model systeem.
Abstract
Inzicht in de rol van menselijk DNA reparatie-eiwitten in genetische paden is een geweldige uitdaging voor veel onderzoekers. Genetische studies in zoogdieren systemen zijn te wijten aan het gebrek aan direct beschikbare tools, zoals gedefinieerd mutant genetische cellijnen, de regelgeving expressie-systemen, en geschikte selecteerbare merkers beperkt. Om deze moeilijkheden te omzeilen, hebben model genetische systemen in de lagere eukaryoten uitgegroeid tot een aantrekkelijke keuze voor de studie van functioneel geconserveerd DNA reparatie-eiwitten en routes. We hebben een model ontwikkeld gist systeem om de slecht gedefinieerde genetische functies van het Werner syndroom helicase-nuclease studie (<em> WRN</em>) In nucleïnezuur metabolisme. Cellulaire fenotypes geassocieerd met bepaalde genetische mutant achtergrond kunnen worden onderzocht om de cellulaire en moleculaire functies van de duidelijkheid<em> WRN</em> Door zijn katalytische activiteiten en eiwit interacties. Het menselijk<em> WRN</em> Gen en bijbehorende varianten, gekloneerd in DNA-plasmiden voor expressie in gist, kunnen worden geplaatst onder de controle van een regelgevend plasmide element. De expressie-construct kan dan worden omgezet in de juiste gist mutant achtergrond, en genetische functie getest door een verscheidenheid van methodieken. Met behulp van deze aanpak, hebben we vastgesteld dat<em> WRN</em>, Net als de bijbehorende RecQ familieleden BLM en Sgs1, opereert in een top3-afhankelijke route die waarschijnlijk belangrijk zijn voor genomische stabiliteit. Dit wordt beschreven in onze recente publicatie [1] op<a href="http://www.impactaging.com"> Www.impactaging.com</a>. Gedetailleerde methoden van specifieke tests voor genetische complementatie studies in gist zijn in dit document.
Protocol
Discussion
Een van de sterke punten van het gebruik van gist als model systeem is de beschikbaarheid van de mutanten in bepaalde DNA-replicatie en reparatie trajecten die zijn geconserveerd tussen gist en mens. Verdere selectie van transformanten herbergen de specifieke genen is makkelijk en betrouwbaar als het laboratorium stammen auxotrofe mutanten en vectoren met auxotrofe markers zijn direct beschikbaar. Met behulp van deze vectoren de expressie van het gen-producten kan worden geregeld door ze onder de controle van een induce…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund volledig door de Intramurale Research programma van de NIH, National Institute on Aging. Wij danken Dr Rodney Rothstein (Columbia University) voor de giststammen en Dr Brad Johnson (University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania) voor de SGS1 expressieplasmide.
References
- Aggarwal, M., Brosh, R. M. WRN helicase defective in the premature aging disorder Werner Syndrome genetically interacts with Topoisomerase 3 and restores the top3 slow growth phenotype of sgs1 top3. Aging. 1, 219-233 (2009).
- Gangloff, S., McDonald, J. P., Bendixen, C., Arthur, L., Rothstein, R. The yeast type I topoisomerase Top3 interacts with Sgs1, a DNA helicase homolog: a potential eukaryotic reverse gyrase. Mol Cell Biol. 14, 8391-8398 (1994).
- Shor, E., Gangloff, S., Wagner, M., Weinstein, J., Price, G., Rothstein, R. Mutations in homologous recombination genes rescue top3 slow growth in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 162, 647-662 (2002).
- Sharma, S., Sommers, J. A., Brosh, R. M. In vivo function of the conserved non-catalytic domain of Werner syndrome helicase in DNA replication. Hum Mol Genet. 13, 2247-2261 (2004).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- von Kobbe, C., Thoma, N. H., Czyzewski, B. K., Pavletich, N. P., Bohr, V. A. Werner syndrome protein contains three structure specific DNA binding domains. J Biol Chem. 278, 52997-53006 (2003).
