Les études génétiques des protéines humaines réparation de l'ADN utilisant de la levure comme système modèle
Summary
Des études génétiques chez la levure peut être utilisée pour étudier les fonctions cellulaires et moléculaires de gènes humains dans le métabolisme de l'ADN cellulaire. Les méthodes sont décrites pour la caractérisation génétique de l'humain<em> WRN</emProduit du gène> défectueux dans le syndrome de vieillissement prématuré des troubles fonctionnels des voies de Werner conservé utilisant de la levure comme système modèle souple.
Abstract
Comprendre les rôles des protéines humaines dans les voies de réparation de l'ADN génétique est un formidable défi pour beaucoup de chercheurs. Des études génétiques dans les systèmes mammifères ont été limités en raison du manque d'outils disponibles tels que définis mutant génétique des lignées cellulaires, les systèmes de régulation de l'expression, et des marqueurs de sélection appropriés. Pour contourner ces difficultés, les systèmes de modèle génétique chez les eucaryotes inférieurs sont devenus un choix attrayant pour l'étude des protéines fonctionnellement conservé réparation de l'ADN et les voies. Nous avons développé un système de levure modèle pour étudier les fonctions mal définies génétique du syndrome de Werner hélicase-nucléase (<em> WRN</em>) Dans le métabolisme des acides nucléiques. Phénotypes cellulaires associés à définir génétique milieux mutant peut être étudiée afin de clarifier les fonctions cellulaires et moléculaires de<em> WRN</em> Grâce à ses activités catalytiques et les interactions entre protéines. L'être humain<em> WRN</emGénique> et des variantes associées, clonés dans des plasmides d'ADN pour l'expression dans la levure, peuvent être placés sous le contrôle d'un élément de régulation de plasmide. La construction d'expression peut alors être transformé dans le fond de la levure appropriée mutant, et de la fonction génétique dosés par une variété de méthodologies. En utilisant cette approche, nous avons déterminé que<em> WRN</em>, Comme ses membres de la famille liés RecQ BLM et Sgs1, opère dans une voie Top3-dépendante qui est susceptible d'être important pour la stabilité génomique. Cette procédure est décrite dans notre publication récente [1] à<a href="http://www.impactaging.com"> Www.impactaging.com</a>. Des méthodes détaillées de tests spécifiques pour les études de complémentation génétique dans la levure sont fournies dans ce document.
Protocol
Discussion
Une des forces de l'utilisation de la levure comme système modèle est la disponibilité de mutants dans la réplication d'ADN définies et les voies de réparation qui sont conservés entre les levures et les humains. En outre la sélection des transformants abritant les gènes spécifiques est facile et fiable que les souches de laboratoire sont des mutants auxotrophes et les vecteurs avec des marqueurs auxotrophes sont facilement disponibles. L'utilisation de ces vecteurs de l'expression des produits…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu dans son intégralité par le programme de recherche intra-muros de l'Institut des NIH, National sur le Vieillissement. Nous remercions le Dr Rodney Rothstein (Columbia University) pour les souches de levure et le Dr Brad Johnson (University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphie, Pennsylvanie) pour l'expression SGS1 plasmide.
References
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