Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Beobachtung der Echtzeit-Replikation einzelner DNA-Moleküle durch Proteine des Bakteriophagen Replikationssystem vermittelt.
Abstract
Wir beschreiben eine Methode zur Beobachtung der Echtzeit-Replikation einzelner DNA-Moleküle durch Proteine des Bakteriophagen Replikationssystem vermittelt. Linearisierte λ DNA wird modifiziert, um ein Biotin auf das Ende eines Stranges, und ein Digoxigenin-Rest am anderen Ende des gleichen Strang zu haben. Der biotinylierte Ende mit einem funktionalisierten Deckglas und die digoxigeninated Ende eine kleine Perle befestigt. Die Montage dieser DNA-Bead Anbindehaltung auf der Oberfläche einer Durchflusszelle ermöglicht eine Laminar-Flow anzuwenden, um eine Zugkraft auf dem Wulst auszuüben. Als Ergebnis wird die DNA in der Nähe und parallel zur Oberfläche des Deckglases mit einer Kraft, die durch den Durchfluss (Abbildung 1) bestimmt wird gestreckt. Die Länge der DNA wird durch die Überwachung der Position der Perle gemessen. Länge Unterschiede zwischen Einzel-und Doppelstrang-DNA werden genutzt, um in Echtzeit Informationen über die Tätigkeit der Replikation Proteine an der Gabelung zu erhalten. Die Messung der Position der Sicke ermöglicht eine präzise Bestimmung der Preise und processivities von DNA Abwickeln und Polymerisation (Abbildung 2).
Protocol
Discussion
Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Zugkraft auf Kügelchen von Laminar-Flow ausgeübt hat keinen Einfluss auf enzymatische Aktivitäten der Replikation Proteine. Zum Beispiel hat ein 3 pN Kraft, die zu einem Durchfluss von 0,012 ml / min entspricht nicht berührt Replikation der DNA-Strang führt. Es hat jedoch Auswirkungen auf enzymatische Aktivitäten, die während koordiniert die DNA-Synthese, und es muss daher auf 1,5 pN reduziert werden. Die Zugkraft kann durch Änderung der Strömungsgeschwindigkeit oder…
Acknowledgements
Die Entwicklung der DNA Stretching Assay wurde durch Paul Blainey, Jong-Bong Lee, und Samir Hamdan unterstützt. Diese Arbeit wird durch die National Institutes of Health gewährt Charles Richardson (GM54397) und Antoine van Oijen (GM077248) unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bacteriophage λ DNA | New England Biolabs | N3011L | ||
| DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | ||
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | ||
| α-digoxigenin Fab | Roche | 11214667001 | ||
| Tosyl Activated Beads | Dynal/Invitrogen | 142-03 | ||
| Magnetic Separator | Invitrogen | Dynal MPC | ||
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma | A3648 | Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces | |
| Succinimidyl propionate PEG | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Biotin-PEG-NHS | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Double-sided tape | Grace BioLabs | SA-S-1L | 100 μm thickness | |
| Quartz slide | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) | Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net) | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson | 427416 | 0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted. |
|
| Streptavidin | Sigma | S4762 | Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3 | |
| Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix | New England Biolabs | N0447 | ||
| Inverted Optical Microscope with 10X Objective | Olympus | Olympus IX-51 | ||
| Permament rare-earth magnet | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | ||
| CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 11 Plus | Operate in refill mode to facilitate solution changes | |
| Fiber Illuminator | Thorlabs Inc. | OSL1 |
References
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. J Vis Exp. , (2009).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, 336-339 (2009).
- van Oijen, A. M. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
