אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.
Abstract
אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage. לינארית λ-DNA הוא שונה יש ביוטין על קצה חוט אחד, מחצית digoxigenin בצד השני של גדיל אחד. סוף biotinylated מחובר coverslip כוס פונקציונליות לבין סוף digoxigeninated כדי חרוז קטן. הרכבה של אלה-DNA חרוז חבלים על פני השטח של התא זרימה מאפשר זרימה למינרית להיות מיושם להפעיל כוח לגרור על החרוז. כתוצאה מכך, ה-DNA הוא נמתח קרוב ובמקביל פני השטח של coverslip לעבר הכוח אשר נקבעת על ידי קצב הזרימה (איור 1). אורכו של ה-DNA נמדד על ידי ניטור את המיקום של החרוז. הבדלי אורך בין דנ"א יחיד ו פעמיים תקועים מנוצלים לקבל מידע בזמן אמת על פעילות החלבונים שכפול במזלג. מדידת המיקום של החרוז מאפשר קביעה מדויקת של שיעורי processivities של ה-DNA ואת ההתרה פילמור (איור 2).
Protocol
1. שכפול ה-DNA תבנית DNA עבור התגובה הינה DNA λ לינארית שונה על ידי חישול של oligonucleotides להקים מזלג שכפול. בנוסף, ביוטין מצורף בסופו של גדיל אחד של הדנ"א λ, וכן מחצית digoxigenin מחוברת בקצה השני של הגדיל אותו 1. <p class="jove_content" style=";text-align:righ…
Discussion
חשוב להבטיח כי כוח הגרר המופעל על ידי זרימה למינרית חרוזים אינו משפיע על פעילות אנזימטית של חלבונים שכפול. למשל, כוח 3 PN המתאים קצב זרימה של 0.012 ml / min לא משפיע השכפול של גדיל DNA מובילים. היא עושה זאת להשפיע על הפעילות האנזימטית המתרחשים במהלך סינתזת DNA מתואמת, ולכן יש לצמ?…
Acknowledgements
הפיתוח של ה-DNA מתיחה assay נעזרה פול Blainey, בונג ג'ונג לי, סמיר חמדאן. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים לצ'ארלס ריצ'רדסון (GM54397) ואנטואן ואן Oijen (GM077248).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Bacteriophage λ DNA
New England Biolabs
N3011L
DNA Oligonucleotides
Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase
New England Biolabs
M0202L
T4 Polynucleotide Kinase
New England Biolabs
M0201L
α-digoxigenin Fab
Roche
11214667001
Tosyl Activated Beads
Dynal/Invitrogen
142-03
Magnetic Separator
Invitrogen
Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane
Sigma
A3648
Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Double-sided tape
Grace BioLabs
SA-S-1L
100 μm thickness
Quartz slide
Technical Glass
20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)
Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing
Becton Dickinson
427416
0.76 mm ID, 1.22 OD
Other size tubing can be substituted.
Streptavidin
Sigma
S4762
Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix
New England Biolabs
N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective
Olympus
Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet
National Imports
www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera
QImaging
Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump
Harvard Apparatus
11 Plus
Operate in refill mode to facilitate solution changes
Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J. Vis. Exp. (37), e1689, doi:10.3791/1689 (2010).