효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여
Summary
우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다.
Abstract
우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다. 선형 λ DNA는 한 가닥의 끝 부분에 비오틴과 같은 스트랜드의 다른 끝에 digoxigenin의 잔기을 가지고 수정됩니다. biotinylated 결국은 기능화 유리 coverslip과 작은 구슬로 digoxigeninated 끝에 첨부되어 있습니다. 흐름 세포의 표면에 이러한 DNA – 비즈 tethers의 조립이 층류가 구슬에 드래그 힘을 발휘에 적용할 수 있습니다. 결과적으로 DNA가와 병렬 유량 (그림 1)에 의해 결정됩니다 강제에 coverslip의 표면 가까이에 뻗어있다. DNA의 길이는 비드의 위치를 모니터링하여 측정됩니다. 단일 및 이중 좌초된 DNA 사이의 길이 차이는 분기점에서 복제 단백질의 활동에 대한 실시간 정보를 얻을 활용하고 있습니다. 비드의 위치를 측정하는 것은 긴장을 풀기 DNA와 중합 (그림 2)의 속도와 processivities의 정확한 결정을하실 수 있습니다.
Protocol
Discussion
층류 흐름에 의해 구슬을 끼쳤다 드래그 팀은 복제 단백질의 효소 활동에 영향을 미치지 않도록하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 0.012 ML / 분 유량에 해당하는 3 PN 인력은 DNA 선도 가닥의 복제에는 영향을 미치지 않습니다. 그것은 그러나 조정의 DNA 합성 동안을 효소 활동에 영향을 미치지 않으며, 그것은 따라서 1.5 PN을 줄일 수있다. 드래그 힘을 쉽게 유속 또는 유량 채널 5 너비를 변경하…
Acknowledgements
분석에 이르는 DNA의 발전은 폴 Blainey, 종 봉과 사미르 Hamdan하여 주었되었습니다. 이 작품은 찰스 리차드슨 (GM54397), 그리고 안토니 반 Oijen (GM077248)로 건강을 부여의 국립 연구소에 의해 지원됩니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bacteriophage λ DNA | New England Biolabs | N3011L | ||
| DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | ||
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | ||
| α-digoxigenin Fab | Roche | 11214667001 | ||
| Tosyl Activated Beads | Dynal/Invitrogen | 142-03 | ||
| Magnetic Separator | Invitrogen | Dynal MPC | ||
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma | A3648 | Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces | |
| Succinimidyl propionate PEG | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Biotin-PEG-NHS | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Double-sided tape | Grace BioLabs | SA-S-1L | 100 μm thickness | |
| Quartz slide | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) | Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net) | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson | 427416 | 0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted. |
|
| Streptavidin | Sigma | S4762 | Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3 | |
| Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix | New England Biolabs | N0447 | ||
| Inverted Optical Microscope with 10X Objective | Olympus | Olympus IX-51 | ||
| Permament rare-earth magnet | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | ||
| CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 11 Plus | Operate in refill mode to facilitate solution changes | |
| Fiber Illuminator | Thorlabs Inc. | OSL1 |
References
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. J Vis Exp. , (2009).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, 336-339 (2009).
- van Oijen, A. M. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
