انقسام اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام : أداة قوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات
Summary
الأسطورة يسمح للكشف حساسة للتفاعلات عابرة ومستقرة بين البروتينات التي يتم التعبير عنها في البيرة الكائن السكيراء النموذج. وقد تم تطبيقه بنجاح لدراسة خارجية والخميرة بروتينات الغشاء لا يتجزأ من أجل تحديد شركائهم التفاعل بطريقة إنتاجية عالية.
Abstract
دفعت الأهمية الأساسية والسريرية البيولوجي للبروتينات الغشاء لا يتجزأ من تطوير نظام الخميرة المستندة لتحديد إنتاجية عالية من البروتين البروتين التفاعلات (PPI) لبروتينات عبر الغشاء كامل طول. تحقيقا لهذه الغاية ، وضعت في مختبرنا تقسيم اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام. تسمح هذه التكنولوجيا للكشف عن البروتين حساس للتفاعلات عابرة ومستقرة به<em> السكيراء الجعوية</em> بوصفها الكائن المضيف. الأسطورة يستفيد من الملاحظة التي يمكن فصلها إلى قسمين اليوبيكويتين شاردات مستقرة : C – النصف النهائي للخميرة اليوبيكويتين (C<sub> UB</sub>) والنصف N – محطة للشاردة اليوبيكويتين (N<sub> UB</sub>). في الأسطورة ، ويتم تكييف هذا المبدأ لاستخدامها بوصفها "الاستشعار" من البروتين البروتين التفاعلات. باختصار ، هو تنصهر الطعم الغشاء لا يتجزأ من البروتين إلى C<sub> UB</sub> الذي يرتبط إلى عامل النسخ الاصطناعية. البروتينات الفريسة ، سواء في شكل فردي أو مكتبة ، وتنصهر في N<sub> UB</sub> شاردة. التفاعل بين البروتين الطعم وفريسة يؤدي إلى إعادة تشكيل شاردات اليوبيكويتين ، وتشكيل كامل طول "الزائفة اليوبيكويتين' الجزيء. هذا الجزيء هو بدوره معترف بها من قبل الإنزيمات deubiquitinating عصاري خلوي ، مما أدى إلى انشقاق عامل النسخ ، وتحريض لاحقة في التعبير الجيني المراسل. النظام قابل للتكيف إلى حد كبير ، وخاصة مناسبة تماما لفحص سرعة عالية. وقد استخدمتها بنجاح لتحقيق التفاعل باستخدام بروتينات الغشاء لا يتجزأ من كل من الخميرة وغيرها من الكائنات.
Protocol
Discussion
الأسطورة هي أول نظام الإنتاجية العالية التي تسمح بتحديد من التفاعلات بين البروتينات الغشاء كامل طول وعصاري خلوي أو غشاء محدد الشركاء. وقد تم استخدامه لدراسة البروتين الغشاء من مجموعة من الكائنات [3-7]. هناك ، ومع ذلك ، والتفاصيل المحددة التي قد تحتاج إلى تمحيص لضمان ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر ادموندز الفجر لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. يتم اعتماد مختبر Stagljar من أموال من المؤسسة الكندية للابتكار (CFI) ، والمعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) ، ومؤسسة القلب والسكتة الدماغية ، وجمعية السرطان الكندية ، وشركة نوفارتيس.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
References
- Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).
- Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
- Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26 (1), 15-25 (2007).
- Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5187-5192 (1998).
- Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1362-1377 (2008).
- Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278 (39), 37998-38003 (2003).
- Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13 (7), 1744-1753 (2003).
- Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10340-10344 (1994).
- Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269 (17), 12908-12917 (1994).
- Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2 (8), 977-984 (1982).
