基于分体式泛素膜酵母双杂交（神话）系统：一个强大的工具用于识别蛋白质 - 蛋白质相互作用
Summary
神话允许的瞬时和稳定的互动模式生物酵母中表达的蛋白质之间的灵敏的检测。它已成功地应用于研究外源性和酵母的完整的膜蛋白，以确定其在高通量的方式相互作用的合作伙伴。
Abstract
基本的生物和临床不可或缺的膜蛋白的重要性，提示为全长跨膜蛋白的蛋白质相互作用（PPI）的高通量鉴定酵母为基础的系统的发展。为此，我们的实验室开发的分裂泛基于膜酵母双杂交系统（神话）。这种技术允许的瞬时和稳定的蛋白质相互作用的敏感检测<em>酿酒酵母</em作为东道主的有机体。神话的泛素可分隔成两个稳定的基团的观察优势：酵母C -末端的一半的泛素（彗星<sub> UB</sub>）和泛素基的N -末端的一半（N<sub> UB</sub>）。在神话中，这一原则适用于使用，作为一种“传感器”蛋白质 – 蛋白质相互作用。简言之，积分膜诱饵蛋白融合到C<sub> UB</sub>这是与人工转录因子。猎物的蛋白质，无论是在个人或库格式，融合到N<sub> UB</sub>基团。诱饵和猎物之间的蛋白质相互作用导致泛基团的重组，形成一个完整长度的“伪泛”分子。这种分子是由胞质deubiquitinating酶的认可，产生的转录因子，随后诱导报告基因的表达裂解。该系统适应性强，特别适合于高通量筛选。它已成功地调查使用从酵母和其他微生物的整合膜蛋白的相互作用。
Protocol
Discussion
神话是第一个高通量确定全长膜蛋白和胞浆或膜结合的合作伙伴之间的的相互作用的系统，使。它已被用于研究膜蛋白的生物体[3-7]。有，但是，具体的细节，可能需要经过严格审核的程序，以确保蛋白质的利益服从研究神话。
许多膜结合蛋白裂解产生的成熟蛋白的信号序列，随后通过质膜。这个序列是生物体的特定的和有可能，这个原始信号序列在酵母中表达时，会导致定…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们想感谢黎明埃德蒙兹关键读了这篇稿子。 Stagljar实验室是由从加拿大创新（CFI），加拿大卫生研究所（CIHR），心脏及中风基金会，加拿大癌症协会，和诺华基金会的资金支持。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
References
- Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).
- Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
- Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26 (1), 15-25 (2007).
- Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5187-5192 (1998).
- Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1362-1377 (2008).
- Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278 (39), 37998-38003 (2003).
- Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13 (7), 1744-1753 (2003).
- Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10340-10344 (1994).
- Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269 (17), 12908-12917 (1994).
- Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2 (8), 977-984 (1982).
