Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות
Summary
מיתוס מאפשר זיהוי רגיש של אינטראקציות חולף ויציב בין חלבונים לידי ביטוי cerevisiae אורגניזם מודל Saccharomyces. זה כבר מיושם בהצלחה מחקר אקסוגניים ושמרים חלבונים בממברנה נפרד על מנת לזהות שותפים באינטראקציה שלהם באופן תפוקה גבוהה.
Abstract
חשיבות ביולוגית קליניים היסוד של חלבונים בממברנה נפרד מתבקש הפיתוח של מערכת שמרים מבוססי זיהוי תפוקה גבוהה של חלבונים אינטראקציות (PPI) עבור באורך מלא חלבונים הטרנסממברני. לשם כך, פיתח את המעבדה שלנו שמרים מפוצל היוביקוויטין ממברנה המבוססת שני היברידי (מיתוס) של המערכת. טכנולוגיה זו מאפשרת לגילוי רגיש של אינטראקציות חלבון חולף ויציבה באמצעות<em> Saccharomyces cerevisiae</em> כמו הפונדקאי. מיתוס מנצל התצפית כי היוביקוויטין ניתן להפריד לשתי moieties יציב: חצי C-טרמינל של שמרים היוביקוויטין (C<sub> UB</sub>) ואת החצי N-מסוף של מחצית היוביקוויטין (N<sub> UB</sub>). במיתוס, עיקרון זה הוא מותאם לשימוש כ 'חיישן' של חלבונים אינטראקציות. בקצרה, חלבון אינטגרלי בממברנה הפיתיון הוא התמזגו ל-C<sub> UB</sub> אשר קשורה גורם שעתוק מלאכותית. חלבונים Prey, או בפורמט הפרט או לספריה, הם התמזגו עם N<sub> UB</sub> מחצית. האינטראקציה בין חלבון הפיתיון וטרף מוביל הכינון מחדש של moieties היוביקוויטין, ויצרו באורך מלא "פסאודו היוביקוויטין" מולקולה. מולקולה זו בתורו מוכר על ידי האנזימים deubiquitinating cytosolic, וכתוצאה מכך המחשוף של גורם שעתוק, ואינדוקציה הבאות של ביטוי גנים הכתב. המערכת ניתנת להתאמה מאוד, במיוחד מתאימים כדי ההקרנה תפוקה גבוהה. זה כבר עובד בהצלחה לחקור אינטראקציות באמצעות חלבונים בממברנה בלתי נפרד מן שמרים והן אורגניזמים אחרים.
Protocol
Discussion
מיתוס היא המערכת הראשונה תפוקה גבוהה המאפשרת זיהוי של אינטראקציות בין באורך מלא חלבונים בממברנה ו cytosolic או קרום הנכנס שותפים. זה כבר נעשה שימוש כדי ללמוד חלבון קרום מתוך מגוון רחב של אורגניזמים [3-7]. יש, עם זאת, פרטים ספציפיים כי ייתכן שיהיה צורך בחנו כדי להבטיח את החלב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות אדמונדס שחר לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. המעבדה Stagljar נתמכת על ידי קרנות מקרן קנדה עבור חדשנות (CFI), המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR), קרן לב ושבץ, האגודה למלחמה בסרטן הקנדי, נוברטיס.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
References
- Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).
- Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
- Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26 (1), 15-25 (2007).
- Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5187-5192 (1998).
- Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1362-1377 (2008).
- Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278 (39), 37998-38003 (2003).
- Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13 (7), 1744-1753 (2003).
- Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10340-10344 (1994).
- Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269 (17), 12908-12917 (1994).
- Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2 (8), 977-984 (1982).
