بروتوكول لإنتاج Tetramer KLRG1
Summary
يصف هذا البروتوكول إنتاج tetramer KLRG1 ، الذي هو أداة قوية لتحليل KLRG1 يغاندس.
Abstract
قاتل مستقبلات الخلية G1 lectin مثل (KLRG1) هي عبر الغشاء مستقبلات بروتين سكري من النوع الثاني المثبطة ينتمون إلى الفصيلة C lectin تشبه النوع. KLRG1 موجود بوصفه على حد سواء ونتيجة لمونومر homodimer ثاني كبريتيد مرتبطة. تم العثور على هذه المستقبلات جيدا الحفاظ على خلايا NK الأكثر نضجا وتفعيلها مؤخرا فضلا عن مجموعة فرعية من خلايا تي المستجيب / الذاكرة.
باستخدام KLRG1 tetramer فضلا عن أساليب أخرى ، E ، N ، وحددت R – cadherins كما KLRG1 يغاندس. هذه كا + التي تعتمد على خلية خلية التصاق جزيئات تتكون من خارج الخلية التي تحتوي على مجال يكرر كادهيرين الخمسة المسؤولة عن الخلية الخلية والتفاعلات ، ومجال وعبر الغشاء مجال هيولي مرتبط إلى الهيكل الخلوي أكتين 2
وكان جيل من tetramer KLRG1 ضرورية لتحديد يغاندس KLRG1. KLRG1 tetramer هو أيضا أداة فريدة لإلقاء الضوء على الأدوار واللعب كادهيرين KLRG1 في تنظيم الاستجابة المناعية وسلامة الأنسجة.
Protocol
Discussion
في هذا البروتوكول ، فإنه يظهر كيفية تنقية ، biotinylate وKLRG1 tetramerize. يمكن أن تستخدم لتسمية KLRG1 tetramer KLRG1 يغاندس بواسطة التدفق الخلوي. على الرغم من الظروف refolding سيتعين اختبارها تجريبيا لكل من البروتين ، يمكن tetramerized غيرها من نوع C – lectins باستخدام بروتوكول مماثل. ويمكن استخدام الب?…
Acknowledgements
نشكر الدكتور Naidenko للمساعدة في تحسين ظروف refolding. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة AI58181 منح البحوث لوران Brossay. سيندي تيا بانه معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة NRSA AI080230 F31.
ستيفاني Terrizzi تيا بانه وسيندي أيضا أن تساهم في هذا العمل.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , .
