Um protocolo para a Produção de KLRG1 tetrâmero
Summary
Este protocolo descreve a produção de KLRG1 tetrâmero, que é uma ferramenta poderosa para a análise de KLRG1 ligantes.
Abstract
Assassino celular G1 receptor lectina-like (KLRG1) é um tipo de receptor da glicoproteína transmembrana II inibitória pertencentes à superfamília tipo C lectina-like. KLRG1 existe tanto como um monômero e como um homodímero dissulfeto ligadas. Este receptor bem conservada é encontrada na maioria das células maduras e recentemente activado NK, bem como em um subconjunto de células T efetoras / memória.
Usando KLRG1 tetrâmero, bem como outros métodos, E, N, e R-caderinas foram identificados como KLRG1 ligantes. Estes Ca 2 + dependentes de célula-célula de moléculas de adesão compreende um domínio extracelular contendo cinco repetições caderina responsável por interações célula-célula, um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático que está ligada ao citoesqueleto de actina.
Geração do tetrâmero KLRG1 foi essencial para a identificação do KLRG1 ligantes. KLRG1 tetrâmero é também uma ferramenta única para elucidar a caderina papéis e jogar KLRG1 na regulação da resposta imune e integridade do tecido.
Protocol
Discussion
Neste protocolo, é mostrado como purificar, biotinylate e KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetrâmero pode ser usado para rotular KLRG1 ligantes por citometria de fluxo. Embora as condições refolding terá de ser testado empiricamente para cada proteína, outras lectinas tipo C pode ser tetramerized usando um protocolo similar. Uso de proteínas tetramerized como sondas, ligantes para receptores órfão tipo C lectina poderia ser identificado.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Naidenko para ajudar a otimizar as condições refolding. Este trabalho foi financiado pelo NIH pesquisa conceder AI58181 para Laurent Brossay. Cindy Banh é suportado pelo NIH NRSA F31 AI080230.
Stephanie Terrizzi e Cindy Banh contribuem igualmente para este trabalho.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
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