马赛克斑马鱼转基因增强子序列，以评估

Summary

我们证明我们的方法来寻找潜在发育调控基因的增强子元件和评估它们的功能，通过镶嵌的斑马鱼转基因。

Abstract

人类基因组序列的完成，以及其他许多物种，突出了把特定功能的非编码序列的挑战。由非编码的基因组的一部分进行的一个突出功能是调节基因的转录;但是，有没有有效的方法来大致预测的主要DNA序列的顺式调控元件。我们已经开发出一种高效的协议功能评估潜在的顺式调控，通过斑马鱼转基因的元素。我们的方法提供了发育的重要基因的细胞培养为基础的技术，显着的优势，因为它提供信息的空间和时间的基因调控。相反，它是更快和更昂贵的比类似的实验，在转基因小鼠，我们经常将其应用到人类基因组序列。在这里，我们证明我们的方法来测试序列克隆序列的养护和我们的协议的基础上，显微注射到斑马鱼的胚胎中选择元素。

Protocol

1。选型和测试的保守序列的克隆首先必须找出潜在的调控序列进行功能测试。我们依赖于进化的序列保守性作为标准来选择序列，最经常使用的算法PhastCons，这是作为跟踪UCSC基因组浏览器（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）访问。然而，还有许多其他可用来评估跨物种的序列保守的算法。 一旦我们选择了我们的序列，设计引物扩增基因组DNA的每个序列。应选择引物扩增保守的区域?…

Discussion

我们已经证明，在我们的实验室用于潜在的增强剂使用斑马鱼转基因的高效分析方法。大多数情况下，我们使用这种方法，寻找与人类基因相关的组织特异性的增强剂。尽管缺乏明显的序列同源性之间的人类和鱼类非编码序列，我们发现，这种方法通常是在成功地确定我们感兴趣的基因的增强剂。成功的关键因素，正在编制的质粒DNA和RNA的转座护理，注射和检查每个构造足够数量的胚胎。转基因?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Takara LA Taq		Takara Bio Inc	RR02M
pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit		Invitrogen	K2500-20
Gateway LR Clonase II enzyme Mix		Invitrogen	11791-100
Library efficiency competent cells DH5α		Invitrogen	12535-019
Library efficiency competent cells DB3.1		Invitrogen	11782-018
mMESSAGE mMACHINE Kit		Ambion	AM1340
HiSpeed Plasmid Midi Kit		Qiagen	12643
QIAquick PCR Purification Kit		Qiagen	28104
Flaming/Brown Micropipette Puller		Sutter Instrument	P-97
Pneumatic PicoPump		World Precision Instruments	SYS-PV820