Mosaico Transgenesi Zebrafish per la valutazione sequenze Enhancer
Summary
Dimostriamo il nostro approccio alla ricerca di potenziali elementi enhancer regolati da geni evolutivamente e valutando la loro funzione attraverso transgenesi mosaico zebrafish.
Abstract
Il completamento della sequenza del genoma umano, insieme a quello di molte altre specie, ha evidenziato la sfida di attribuire funzione specifica di non sequenze codificanti. Una funzione importante svolta dalla parte non codificante del genoma è di regolare trascrizione del gene, tuttavia, non esistono metodi efficaci per prevedere in generale cis-normativo elementi di sequenza del DNA primario. Abbiamo sviluppato un protocollo efficiente per la valutazione funzionale potenziale cis-normativo elementi attraverso transgenesi zebrafish. Il nostro approccio offre vantaggi significativi rispetto alle tecniche di coltura cellulare a base di geni evolutivamente importante, poiché fornisce informazioni sulla regolazione genica spaziale e temporale. Al contrario, è più veloce e meno costoso di esperimenti simili in topi transgenici, e noi di routine si applica alle sequenze isolate dal genoma umano. Qui mostriamo il nostro approccio alla selezione di elementi per il test basato sulla conservazione di sequenza e il nostro protocollo per le sequenze di clonazione e microinjecting li in embrioni di zebrafish.
Protocol
Discussion
Abbiamo dimostrato l'approccio utilizzato nel nostro laboratorio per l'analisi efficiente di esaltatori di potenziale utilizzo transgenesi zebrafish. Molto spesso, noi usiamo questo metodo per cercare tessuto-specifici associati con esaltatori di geni umani. Nonostante la mancanza di omologia di sequenza evidente maggior parte del tempo tra uomo e pesce sequenze non codificanti, troviamo che questo approccio è di solito efficace nell'identificare esaltatori per i geni di interesse per noi. I fattori critici…
Acknowledgements
Ringraziamo la signora Paula Roy per l'allevamento di pesce, e Steve Ekker per il gentile dono del pDB600 plasmide. Questi studi sono stati finanziati da una sovvenzione di SF da NHGRI.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | ||
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | ||
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | ||
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | ||
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | ||
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | ||
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (1995).
