Mosaico transgénesis pez cebra para la evaluación de secuencias potenciadoras
Summary
Demostramos nuestro enfoque a la búsqueda de posibles elementos potenciadores de los genes de desarrollo regulado y la evaluación de su función a través de la transgénesis mosaico de pez cebra.
Abstract
La finalización de la secuencia del genoma humano, junto con la de muchas otras especies, ha puesto de relieve el desafío de atribuir funciones específicas a la no codificación de secuencias. Una de las funciones destacadas llevadas a cabo por la fracción no codificantes del genoma es la de regular la transcripción de genes, sin embargo, no existe ningún método eficaz para predecir ampliamente cis-elementos reguladores de la secuencia primaria del ADN. Hemos desarrollado un protocolo eficaz para evaluar funcionalmente posibles elementos reguladores cis-a través de la transgénesis de pez cebra. Nuestro enfoque ofrece ventajas significativas sobre las técnicas de cultivo celular basada en los genes de desarrollo importantes, ya que proporciona información sobre la regulación genética espacial y temporal. Por el contrario, es más rápido y menos costoso que experimentos similares en ratones transgénicos, y que habitualmente se aplica a las secuencias aisladas del genoma humano. Aquí demostramos nuestro enfoque a la selección de los elementos de prueba sobre la base de la secuencia de conservación y el protocolo para las secuencias de la clonación y la microinyección en embriones de pez cebra.
Protocol
Discussion
Hemos demostrado el método utilizado en nuestro laboratorio para el análisis eficiente de los potenciadores del potencial uso de la transgénesis de pez cebra. Muy a menudo, se utiliza este método para buscar tejido-específica potenciadores asociados con genes humanos. A pesar de la falta de homología de secuencia más evidente de la época entre los humanos y los peces secuencias no codificantes, nos encontramos con que este enfoque suele tener éxito en la identificación de los potenciadores de los genes de inte…
Acknowledgements
Agradecemos a la Sra. Paula Roy para la cría de peces de excelente, y Steve Ekker para el tipo de regalo el plásmido pDB600. Estos estudios fueron financiados por una donación a San Francisco de NHGRI.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | ||
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | ||
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | ||
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | ||
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | ||
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | ||
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (1995).
