मोज़ेक बढ़ाने दृश्यों का मूल्यांकन के लिए Zebrafish Transgenesis
Summary
हम developmentally विनियमित जीन से संभावित बढ़ाने तत्वों को खोजने और मोज़ेक zebrafish transgenesis के माध्यम से उनके कार्य का मूल्यांकन करने के लिए हमारे दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है.
Abstract
मानव जीनोम अनुक्रम का पूरा, कि कई अन्य प्रजातियों के साथ, गैर कोडन दृश्यों के लिए विशिष्ट समारोह ascribing की चुनौती पर प्रकाश डाला गया है. एक प्रमुख जीनोम की गैर कोडन अंश से बाहर किए गए एक समारोह के जीन प्रतिलेखन विनियमित करने के लिए है, तथापि, वहाँ कोई कारगर तरीकों के लिए मोटे तौर पर प्राथमिक डीएनए अनुक्रम से सीआईएस नियामक तत्वों की भविष्यवाणी कर रहे हैं. हम एक कुशल प्रोटोकॉल विकसित किया है कार्यात्मक zebrafish transgenesis के माध्यम से संभावित सीआईएस नियामक तत्वों का मूल्यांकन. हमारा दृष्टिकोण developmentally महत्वपूर्ण जीनों के लिए सेल संस्कृति आधारित तकनीकों से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है, के बाद से यह स्थानिक और लौकिक जीन विनियमन पर जानकारी प्रदान करता है. इसके विपरीत, यह तेजी से और कम ट्रांसजेनिक चूहों में इसी तरह के प्रयोगों की तुलना में महंगा है, और हम नियमित मानव जीनोम से अलग दृश्यों के लिए लागू है. यहाँ हम परीक्षण के लिए अनुक्रम और क्लोनिंग के दृश्यों के लिए हमारी प्रोटोकॉल के संरक्षण पर आधारित है और उन्हें zebrafish भ्रूण में microinjecting तत्वों का चयन हमारे दृष्टिकोण का प्रदर्शन.
Protocol
Discussion
हम संभावित zebrafish transgenesis का उपयोग enhancers के कुशल विश्लेषण के लिए हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया है. ज्यादातर अक्सर, हम इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए ऊतक विशिष्ट मानव जीन के स…
Acknowledgements
हम pDB600 प्लाज्मिड की तरह उपहार के लिए उत्कृष्ट मछली पालन के लिए सुश्री पाउला रॉय, और स्टीव Ekker धन्यवाद. इन अध्ययनों NHGRI से एस एफ के लिए एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | ||
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | ||
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | ||
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | ||
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | ||
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | ||
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (1995).
