Mosaic Zebrafish genmodifiering för utvärdering Enhancer sekvenser
Summary
Vi visar vårt sätt att hitta potentiella enhancer element från utvecklingsmässigt gener och utvärdera deras funktion genom mosaik zebrafisk genmodifiering.
Abstract
Slutförandet av människans arvsmassa, tillsammans med många andra arter, har visat på utmaningen att tillskriva särskilda funktion för icke kodande sekvenser. En framträdande funktion utföras av den icke kodande delen av genomet är att reglera gentranskription, men det finns inga effektiva metoder för att i stort sett förutsäga cis-reglerande element från primär DNA-sekvens. Vi har utvecklat ett effektivt protokoll till funktionellt utvärdera potentiella cis-reglerande element genom zebrafisk genmodifiering. Vårt tillvägagångssätt har betydande fördelar framför cell-kultur baserad teknik för utvecklingsstörda viktiga gener, eftersom det ger information om tid och genreglering. Omvänt är det snabbare och billigare än liknande experiment i transgena möss, och vi rutinmässigt tillämpa den på sekvenser isolerad från det mänskliga genomet. Här kan vi visa vårt tillvägagångssätt för att välja element för testning baserad på sekvens bevarande och våra protokoll för kloning av sekvenser och microinjecting dem i zebrafisk embryon.
Protocol
Discussion
Vi har visat den metod som används i vårt laboratorium för effektiv analys av potentiella förstärkare med zebrafisk genmodifiering. Oftast använder vi denna metod för att leta efter vävnadsspecifika medel i samband med mänskliga gener. Trots bristen på självklara sekvenshomologi delen av tiden mellan människa och fisk icke-kodande sekvenser, finner vi att detta tillvägagångssätt är oftast framgångsrik i att identifiera medel för gener av intresse för oss. De kritiska faktorerna för framgång är att …
Acknowledgements
Vi tackar Paula Roy för utmärkt fisk djurhållning, och Steve Ekker för slags gåva pDB600 plasmiden. Dessa studier har finansierats genom ett bidrag till SF från NHGRI.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | ||
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | ||
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | ||
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | ||
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | ||
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | ||
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (1995).
