Mozaïek zebravis Transgenese voor het evalueren van Enhancer Sequences
Summary
We tonen onze aanpak voor het vinden van potentiële enhancer elementen uit de op ontwikkelingsgebied gereguleerde genen en evalueren van hun functie door middel van mozaïek zebravis transgenese.
Abstract
De voltooiing van het menselijk genoom sequentie, samen met die van vele andere soorten, heeft gewezen op de uitdaging van het toeschrijven van specifieke functie niet coderende sequenties. Een prominente functie uitgevoerd door de niet-coderende deel van het genoom is te regelen gentranscriptie, maar er zijn geen effectieve methoden om in grote lijnen te voorspellen cis-regulatorische elementen van primaire DNA-sequentie. We hebben een efficiënt protocol om functioneel beoordelen van mogelijke cis-regulatorische elementen door middel van zebravis transgenese. Onze aanpak biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van cel-cultuur op basis van technieken voor ontwikkelings belangrijk genen, want het geeft informatie over de ruimtelijke en temporele genregulatie. Omgekeerd, is het sneller en goedkoper dan vergelijkbare experimenten in transgene muizen, en we routinematig toe te passen op sequenties van het menselijk genoom. Hier laten we zien onze benadering van het selecteren van elementen voor het testen op basis van volgorde behoud en onze protocol voor het klonen van sequenties en microinjecting ze in zebravis embryo's.
Protocol
Discussion
We hebben aangetoond dat de aanpak die in ons laboratorium voor de efficiënte analyse van de potentiële versterkers met behulp van zebravis transgenese. Meestal gebruiken we deze benadering te zoeken naar weefsel-specifieke enhancers geassocieerd met menselijke genen. Ondanks het ontbreken van voor de hand liggende sequentiehomologie de meeste van de tijd tussen mens en vis niet-coderende sequenties, vinden we dat deze aanpak succesvol is meestal bij het identificeren van versterkers voor de genen die voor ons van bel…
Acknowledgements
Wij danken mevrouw Paula Roy voor uitstekende vis veeteelt, en Steve Ekker voor het soort geschenk van de pDB600 plasmide. Deze studies werden gefinancierd door een subsidie aan SF van NHGRI.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | ||
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | ||
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | ||
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | ||
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | ||
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | ||
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (1995).
