L'isolement et l'enrichissement des cellules de rat souches mésenchymateuses (CSM) et de séparation des mono-colonie Dérivé MSC
Summary
Rat MSC ont été isolés à partir des fémurs et tibias et ensuite enrichi par tri cellulaire magnétique. Cellules triées ont été confirmés pour l'expression des marqueurs de surface par cytométrie en flux. Ces cellules ont également été cultivées à une densité clonale pour former des colonies isolées et ensuite ces colonies ont été séparés par des cylindres de clonage.
Abstract
MSC sont une population de cellules souches adultes qui est une source prometteuse pour des applications thérapeutiques. Ces cellules peuvent être isolées de la moelle osseuse et peut facilement être séparé des cellules souches hématopoïétiques (CSH) en raison de leur adhésion en plastique. Ce protocole décrit comment isoler des MSC à partir des fémurs et des tibias de rats. Les cellules isolées ont été encore enrichie contre deux marqueurs de surface CD54 et CD90 MSC par tri cellulaire magnétique. L'expression de marqueurs de surface CD54 et CD90 ont ensuite été confirmés par une analyse de cytométrie en flux. HSC marqueur CD45 a également été inclus pour vérifier si les cellules souches mésenchymateuses ont été triés appauvri de CSH. MSC sont naturellement très hétérogènes. Il ya des sous-populations de cellules qui ont des formes différentes, la prolifération et les capacités de différenciation. Ces sous-populations expriment tous les marqueurs connus MSC et aucun marqueur unique n'a pas encore été identifiés pour la sous-populations différentes. Par conséquent, une approche alternative pour séparer les différentes sous-populations est d'utiliser le clonage cylindres de séparer une seule colonie de cellules dérivées. Les cellules provenant de colonies unique peut alors être cultivées et évaluées séparément.
Protocol
Discussion
Ce protocole décrit comment isoler et d'enrichir les MSC. Une méthode pour séparer les cellules mono-colonie dérivée est également intégré. Il ya plusieurs étapes qui sont importantes pour une séparation réussie l'isolement, l'enrichissement et la colonie. Tout en faisant l'isolement cellulaire de rat, il est recommandé de filtrer à travers une passoire cellule ou une maille de nylon stérile de taille similaire pour se débarrasser des caillots de sang et de débris osseux. Après étalemen…
Acknowledgements
Le travail a été soutenu en partie par l'Institut national de la Santé (R01GM079688, R21RR024439 et R21GM075838), la National Science Foundation (EFAC 0.941.055), et la Fondation MSU.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | ||
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | ||
| Cell strainer | BD Bioscience | 352350 | ||
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | ||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| BD Imagnet | BD Bioscience | 552311 | ||
| Biotin mouse IgG2a | BD Bioscience | 555572 | ||
| Biotin mouse IgG1 | BD Bioscience | 555747 | ||
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | ||
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | ||
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | ||
| BD Imag buffer | BD Bioscience | 552362 | ||
| Round-bottom tube | BD Bioscience | 352063 | ||
| Streptavidin particles | BD Bioscience | 557812 | ||
| SA-PE | R&D systems | F0040 | ||
| Cloning cylinder | Sigma | C2059 |
References
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