포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석
Summary
우리는 포유 동물 세포에서 생합성 후 glycoproteins의 초기 생활을 통해 N – 연결 glycans의 변조 분석을위한 방법을 설명합니다. 이것은 metabolically 표시 glycans, glycoproteins와 HPLC에 의해 시험에서 효소 릴리스의 펄스 체이스 분석에 의해 이루어진다.
Abstract
Glc의 첨부 파일<sub> 3</sub> 맨<sub> 9</sub> GlcNAc<sub> 2</sub응급실에서 초기 polypeptides에 올리 고당> 전구체는 분비 단백질에 대한 일반적인 수정입니다. 이 수정은 여러 생물 학적 과정에 연루되었지만, 그 기능의 추가 측면 당단백질 품질 제어 및 인신 매매에 대한 신호의 생산에의 역할 최근 증거로, 신흥 있습니다. 따라서, N – glycans 연결 및 처리에 관한 현상을 집중적으로 조사되고있다. 최근 proteomic 분석을 위해 개발되었습니다 방법은 크게 당단백질 N – glycans 연결의 특성을 향상했습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 관련 설탕 체인 처리의 역학에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. 이를 위해, 라벨링 및 펄스 – 체이스 분석 프로토콜은 일반적으로 복잡하며 매우 낮은 수율을주는 데 사용됩니다. 우리는 여기서 metabolically 표시된 N – 연결 oligosaccharides의 분리 및 분석을위한 간단한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 [2 세포의 라벨을 기반으로 -<sup> 3</sup> H 관심 중 하나를 구체적으로 immunoprecipitated 단백질이나 분자 여과 (Amicon) 다음 엔도 H와 N – glycosidase F와 순차 요법에 의해 일반 당단백질 수영장에서] mannose, denaturing 용해와 oligosaccharides의 효소 놓습니다. 이 방법에서는 고립 oligosaccharides은 단일 monosaccharide의 해상도와 함께, 그들로 구성된 monosaccharide 단위의 숫자에 따라 다양한 glycan 구조 사이의 차별을 허용 HPLC 분석에 대한 입력으로 제공하고 있습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 정상적인 조건에서 펄스 체이스 후 proteasome 억제에 따라 총 세포 glycoproteins 높은 mannose N – 연결 올리 고당 프로파일을 공부할 수 있었다. 이 프로파일은 immunoprecipitated ER – 관련 저하 (ERAD) 기판에서 얻은 것과 비교했다. 우리의 결과는 대부분의 NIH 3T3 세포 glycoproteins은 비교적 안정되는 그들 oligosaccharides의 대부분이 인간의 손질하는 것이 좋습니다<sub> 9-8</sub> GlcNAc<sub> 2</sub>. 반면, 불안 정한 ERAD 기판은 인간을 손질 아르<sub> 6-5</sub> GlcNAc<sub> 2</sub이 종 베어링>을 glycoproteins은 proteasomal 저하의 억제에 축적.
Protocol
Discussion
HPLC 분리 살 세포의 glycans의 펄스 체이스 분석 당단백질의 생활 전반에 걸쳐 올리 고당 구조 변경의 역학을 연구하는 방법을 제공합니다. 이러한 변경은 ER의 접이식, 품질 관리 및 인신 매매 시스템 2-5에 대한 신호를 생산에 관여하는 성장 증거가있다. 방법뿐만 아니라 관심의 특정 당단백질뿐만 아니라 우리가 대조 특정 ERAD 기판의 운명과 세포 당단백질 수영장의 비교이 문서에 설명된 ?…
Acknowledgements
우리는 기술 지원 Zehavit Frenkel와 산드라 Tolchinsky 감사드립니다. 이 작품은 관련 연구는 이스라엘 과학 재단 (1229년에서 1207년까지)과 독일 – 이스라엘 프로젝트 협력 (DIP – DFG)에서 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | ||
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck Bioscience | 1.0003 | ||
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | Millipore | UFC503024 or 4208 | ||
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | ||
| Dialyzed Foetal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco Invitrogen Cell Culture | 41965039 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | ||
| EDTA disodium salt (Titriplex Iii) | Merck | 1084180250 | ||
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | ||
| Foetal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | ||
| Frac-100 fraction collector | Amersham Biosciences | 18-1000-77 | ||
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter | 510720 | ||
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer Life Sciences | NET570A | ||
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | ||
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche | 11365177 | ||
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | ||
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1658 | ||
| Opti-Flour | PerkinElmer Life Sciences | 6013199 | ||
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | ||
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | ||
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | ||||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | ||
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-RAD | 161-0301 | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | ||
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | ||
| Triton X-100 | BDH | 306324N | ||
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | ||
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | ||||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | ||||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
