Pulse-chase Analyse des chaînes de sucre N-glycoprotéines liées à des cellules de mammifères
Summary
Nous décrivons une méthode pour l'analyse de l'altération des N-glycanes par le début de la vie des glycoprotéines après leur biosynthèse dans les cellules de mammifères. Ceci est réalisé par pulse-chase analyse des glycanes métaboliquement étiquetés, libération enzymatique des glycoprotéines et l'examen par HPLC.
Abstract
Fixation du Glc<sub> 3</sub> Man<sub> 9</sub> GlcNAc<sub> 2</subPrécurseur> oligosaccharide polypeptides naissants à l'urgence est une modification commune pour les protéines de sécrétion. Bien que cette modification a été impliqué dans plusieurs processus biologiques, d'autres aspects de sa fonction sont émergents, avec des preuves récentes de son rôle dans la production de signaux de contrôle de qualité glycoprotéine et la traite. Ainsi, les phénomènes liés à N-glycanes et leur traitement sont intensivement étudiés. Les méthodes qui ont été récemment développés pour l'analyse protéomique ont grandement amélioré la caractérisation de la glycoprotéine N-glycanes. Néanmoins, ils ne fournissent pas un aperçu de la dynamique de la chaîne de traitement de sucre impliqués. Pour cela, l'étiquetage et des protocoles d'analyse pulse-chase sont utilisés qui sont généralement complexes et donnent des rendements très faibles. Nous décrivons ici une méthode simple pour l'isolement et l'analyse des métaboliquement marquées oligosaccharides N-liés. Le protocole est basé sur l'étiquetage des cellules avec [2 -<sup> 3</sup> H] mannose, la dénaturation et la lyse libération enzymatique d'oligosaccharides à partir soit d'une protéine spécifiquement immunoprécipitée d'intérêt ou de la piscine glycoprotéine générale par des traitements séquentiels avec l'endo H et N-glycosidase F, suivie d'une filtration moléculaire (Amicon). Dans cette méthode, les oligosaccharides isolés servir d'entrée pour l'analyse HPLC, qui permet la discrimination entre les différentes structures glycanniques selon le nombre d'unités monosaccharides les comprenant, avec une résolution d'un monosaccharide unique. En utilisant cette méthode, nous avons pu étudier haute mannose N-liés profils oligosaccharides des glycoprotéines cellulaires total après pulse-chase dans des conditions normales et sous l'inhibition du protéasome. Ces profils ont été comparés à ceux obtenus à partir d'un immunoprécipité ER-associé de la dégradation (ERAD) substrat. Nos résultats suggèrent que la plupart des NIH 3T3 glycoprotéines cellulaires sont relativement stables et que la plupart de leurs oligosaccharides sont taillés à l'Homme<sub> 9-8</sub> GlcNAc<sub> 2</sub>. En revanche, les substrats ERAD instables sont taillés à l'Homme<sub> 6-5</sub> GlcNAc<sub> 2</sub> Et des glycoprotéines portant ces espèces s'accumuler sur l'inhibition de la dégradation par le protéasome.
Protocol
Discussion
L'analyse pulse-chase de glycanes dans des cellules vivantes avec une séparation par HPLC fournit une méthode pour étudier la dynamique de l'oligosaccharide modifications structurelles à travers la vie d'une glycoprotéine. Il ya plus de preuves que ces altérations sont impliquées dans la production des signaux pour le pliage ER, contrôle de la qualité et la traite des systèmes de 2-5. La méthode peut être appliquée non seulement pour une glycoprotéine d'intérêt particuliers, ma…
Acknowledgements
Nous remercions Zehavit Frenkel et Sandra Tolchinsky d'assistance technique. Les recherches liées à ce travail est soutenu par des subventions de la Fondation Sciences d'Israël (1229-1207) et de la Coopération allemande Project-israélien (DIP-DFG).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | ||
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck Bioscience | 1.0003 | ||
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | Millipore | UFC503024 or 4208 | ||
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | ||
| Dialyzed Foetal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco Invitrogen Cell Culture | 41965039 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | ||
| EDTA disodium salt (Titriplex Iii) | Merck | 1084180250 | ||
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | ||
| Foetal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | ||
| Frac-100 fraction collector | Amersham Biosciences | 18-1000-77 | ||
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter | 510720 | ||
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer Life Sciences | NET570A | ||
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | ||
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche | 11365177 | ||
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | ||
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1658 | ||
| Opti-Flour | PerkinElmer Life Sciences | 6013199 | ||
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | ||
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | ||
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | ||||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | ||
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-RAD | 161-0301 | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | ||
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | ||
| Triton X-100 | BDH | 306324N | ||
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | ||
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | ||||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | ||||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
