نبض مطاردة تحليل سلاسل السكر N - الموصولة من جليكوبروتينات في خلايا الثدييات
Summary
نحن تصف طريقة لتحليل تحوير N – مرتبطة glycans خلال السنوات الاولى من حياة جليكوبروتينات بعد الحيوي في خلايا الثدييات. ويتحقق ذلك من خلال نبض مطاردة تحليل عملية الأيض glycans المسمى ، وإطلاق سراح من الأنزيمية جليكوبروتينات والفحص بواسطة HPLC.
Abstract
تعلق GLC<sub> 3</sub> مان<sub> 9</sub> GlcNAc<sub> 2</sub> السلائف oligosaccharide البروتينية لالوليدة في لائحة مشتركة هو تعديل للبروتينات إفرازية. على الرغم من أن هذا التعديل كان متورطا في العديد من العمليات البيولوجية ، وجوانب إضافية من وظيفتها والناشئة ، مع الأدلة الأخيرة لدورها في إنتاج الإشارات لمراقبة جودة بروتين سكري والاتجار بها. وبالتالي ، يجري الظواهر المتصلة N – مرتبطة glycans وتجهيزها التحقيق بشكل مكثف. وقد تحسنت الأساليب التي تم تطويرها مؤخرا لتحليل البروتين إلى حد كبير من توصيف glycans N – يرتبط بروتين سكري. ومع ذلك ، فإنها لا توفر نظرة ثاقبة على ديناميات السكر معالجة سلسلة المعنية. لهذا ، تستخدم الملصقات وبروتوكولات تحليل نبض المطاردة التي عادة ما تكون معقدة وتعطي غلة منخفضة جدا. نحن هنا وصف طريقة بسيطة لعزل وتحليل عملية الأيض oligosaccharides N – يرتبط المسمى. ويستند البروتوكول المتعلق بوضع العلامات على الخلايا مع [2 –<sup> 3</sup> H] مانوز ، والافراج عن تغيير طبيعة تحلل الأنزيمي من oligosaccharides من البروتين إما immunoprecipitated تحديدا في المصالح أو من تجمع بروتين سكري العامة ، من خلال العلاجات متتابعة مع إندو H و N – F غليكوزيداز ، تليها الترشيح الجزيئي (Amicon). في هذا الأسلوب oligosaccharides معزولة كمدخل لتحليل HPLC ، والتي تسمح بالتمييز بين الهياكل غليكان المختلفة وفقا لعدد من وحدات أحادي السكاريد تتألف منهم ، مع قرار من أحادي السكاريد واحد. باستخدام هذه الطريقة تمكنا من دراسة عالية مانوز N – ربط التشكيلات oligosaccharide من مجموع جليكوبروتينات الخلية بعد نبض مطاردة في ظروف طبيعية وتحت تثبيط proteasome. وتمت مقارنة هذه الأوضاع لتلك التي حصلنا عليها من immunoprecipitated ER المرتبطة الركيزة (اراد) تدهورها. نتائجنا تشير الى ان معظم NIH 3T3 جليكوبروتينات الخلوية مستقرة نسبيا ، والتي قلصت معظم oligosaccharides لمان<sub> 9-8</sub> GlcNAc<sub> 2</sub>. في المقابل ، يتم قطع اراد ان ركائز مستقرة للانسان<sub> 6-5</sub> GlcNAc<sub> 2</sub> جليكوبروتينات وتحمل هذه الأنواع تتراكم على تثبيط تدهور proteasomal.
Protocol
Discussion
تحليل نبض مطاردة glycans في الخلايا الحية مع الفصل HPLC يوفر طريقة لدراسة ديناميات التعديلات الهيكلية oligosaccharide طوال حياة بروتين سكري. هناك أدلة متزايدة على أن يتم تضمين هذه التعديلات في إنتاج الإشارات للطي ER ، ومراقبة الجودة ونظم الاتجار 2-5. ويمكن تطبيق الأسلوب ليس ف…
Acknowledgements
نشكر زيهافيت فرانكل وTolchinsky ساندرا لتقديم المساعدة التقنية. وتدعم البحوث المتعلقة في هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم إسرائيل (1229-1207) والألمانية والإسرائيلية لمشاريع التعاون (DIP – DFG).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | ||
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck Bioscience | 1.0003 | ||
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | Millipore | UFC503024 or 4208 | ||
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | ||
| Dialyzed Foetal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco Invitrogen Cell Culture | 41965039 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | ||
| EDTA disodium salt (Titriplex Iii) | Merck | 1084180250 | ||
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | ||
| Foetal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | ||
| Frac-100 fraction collector | Amersham Biosciences | 18-1000-77 | ||
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter | 510720 | ||
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer Life Sciences | NET570A | ||
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | ||
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche | 11365177 | ||
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | ||
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1658 | ||
| Opti-Flour | PerkinElmer Life Sciences | 6013199 | ||
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | ||
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | ||
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | ||||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | ||
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-RAD | 161-0301 | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | ||
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | ||
| Triton X-100 | BDH | 306324N | ||
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | ||
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | ||||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | ||||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
