Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero
Summary
Se describe un método para el análisis de la alteración de la N-glicanos ligados a través de los primeros años de vida de las glicoproteínas después de su biosíntesis en células de mamíferos. Esto se logra mediante pulso-caza análisis de glicanos metabólicamente etiquetados, liberación enzimática de las glicoproteínas y análisis por HPLC.
Abstract
La unión de la Glc<sub> 3</sub> Hombre<sub> 9</sub> GlcNAc<sub> 2</subPrecursor> oligosacáridos a polipéptidos nacientes en la sala de emergencia es una modificación común para proteínas secretoras. A pesar de esta modificación fue implicado en numerosos procesos biológicos, otros aspectos de su función están surgiendo, con la evidencia reciente de su papel en la producción de señales para el control de la calidad de la glicoproteína y la trata. Por lo tanto, fenómenos relacionados con la N-glicanos ligados y su tratamiento están siendo intensamente investigados. Los métodos que se han desarrollado recientemente para el análisis de proteómica han mejorado mucho la caracterización de la glicoproteína N-glicanos ligados. Sin embargo, no proporcionar información sobre la dinámica de la cadena de elaboración de azúcar en cuestión. Para ello, el etiquetado y el pulso-caza protocolos de análisis que se utilizan suelen ser complejos y dan rendimientos muy bajos. Se describe aquí un método sencillo para el aislamiento y el análisis de metabólicamente etiquetados N-oligosacáridos. El protocolo se basa en el etiquetado de las células con [2 -<sup> 3</sup> H] manosa lisis, la desnaturalización y la liberación enzimática de los oligosacáridos de cualquiera de una proteína específica immunoprecipitated de interés o de la piscina glicoproteína en general por los tratamientos secuenciales con endo H y N-glucosidasa F, seguido por filtración molecular (Amicon). En este método, los oligosacáridos aislados servir como insumo para el análisis por HPLC, que permite la discriminación entre las diversas estructuras de glicanos en función del número de unidades de monosacáridos que los componen, con una resolución de un monosacárido individual. El uso de este método hemos sido capaces de estudio de alta manosa unidos a N perfiles de oligosacáridos de glicoproteínas total de células después del pulso de la Caza en condiciones normales y en la inhibición del proteosoma. Estos perfiles fueron comparados con los obtenidos de una ER-immunoprecipitated asociados degradación (ERAD) sustrato. Nuestros resultados sugieren que la mayoría de los celulares NIH 3T3 glicoproteínas son relativamente estables y que la mayoría de los oligosacáridos se recortan para el hombre<sub> 9.8</sub> GlcNAc<sub> 2</sub>. En contraste, los sustratos inestables ERAD se recortan para el hombre<sub> 5.6</sub> GlcNAc<sub> 2</sub> Y glicoproteínas teniendo estas especies se acumulan en la inhibición de la degradación proteasomal.
Protocol
Discussion
El análisis del pulso-caza de los glicanos en las células vivas con una separación de HPLC proporciona un método para el estudio de la dinámica de los oligosacáridos alteraciones estructurales a lo largo de la vida de una glicoproteína. Hay una creciente evidencia de que tales alteraciones están involucrados en la producción de las señales para doblar ER, control de calidad y sistemas de tráfico 2-5. El método se puede aplicar no sólo para una glicoproteína de interés específico, sino también…
Acknowledgements
Damos las gracias a Zehavit Frenkel y Tolchinsky Sandra de asistencia técnica. La investigación relacionada con este trabajo es apoyado por becas de la Fundación Ciencia Israel (1229-1207) y el alemán-israelí Proyecto de Cooperación (DIP-DFG).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | ||
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck Bioscience | 1.0003 | ||
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | Millipore | UFC503024 or 4208 | ||
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | ||
| Dialyzed Foetal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco Invitrogen Cell Culture | 41965039 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | ||
| EDTA disodium salt (Titriplex Iii) | Merck | 1084180250 | ||
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | ||
| Foetal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | ||
| Frac-100 fraction collector | Amersham Biosciences | 18-1000-77 | ||
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter | 510720 | ||
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer Life Sciences | NET570A | ||
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | ||
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche | 11365177 | ||
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | ||
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1658 | ||
| Opti-Flour | PerkinElmer Life Sciences | 6013199 | ||
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | ||
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | ||
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | ||||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | ||
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-RAD | 161-0301 | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | ||
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | ||
| Triton X-100 | BDH | 306324N | ||
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | ||
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | ||||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | ||||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
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- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
