Puls-jakt Analys av N-bundna sockerkedjor från Glycoproteins i däggdjursceller

Summary

Vi beskriver en metod för analys av förändring av N-bundna glykaner genom tidiga liv glykoproteiner efter deras biosyntes i däggdjursceller. Detta uppnås genom att puls-jakt analys av metaboliskt märkt glykaner, enzymatiska frigivning från glykoproteiner och examination genom HPLC.

Abstract

Infästning av Glc₃ Man₉ GlcNAc₂ Föregångare oligosackarid på begynnande polypeptider i ER är en vanlig modifikation sekretoriska proteiner. Även om denna förändring var inblandad i flera biologiska processer, är ytterligare aspekter av dess funktion att växa fram, med de senaste bevis för sin roll i produktionen av signaler för glykoprotein kvalitetskontroll och människohandel. Således är fenomen relaterade till N-bundna glykaner och deras bearbetning intensivt undersökas. Metoder som nyligen har utvecklats för proteomik analys har förbättrats avsevärt karakterisering av glykoprotein N-bundna glykaner. Ändå ger de inte insikt i dynamiken i socker inblandade kedjan bearbetning. För detta är märkning och puls-jaga-protokoll analysen används som vanligtvis komplexa och ger mycket låg avkastning. Vi beskriver här en enkel metod för isolering och analys av metaboliskt märkt N-bundna oligosackarider. Protokollet är baserat på märkning av celler med [2 -³ H] mannos, denaturering lysering och enzymatisk frigörande av oligosackarider från antingen ett specifikt immunoprecipitated protein av intresse eller från det allmänna glykoprotein poolen med sekventiell behandling med Endo H och N-glycosidase F, följt av molekylär filtrering (Amicon). I denna metod den isolerade oligosackarider fungerar som en ingång för HPLC-analys, som möjliggör diskriminering mellan olika glycan strukturer beroende på antal monosackarid enheter bestående av dem, med en upplösning av en enda monosackarid. Med denna metod kunde vi studera hög mannos N-kopplade oligosackarid profiler av det totala cell glykoproteiner efter puls-jakt under normala förhållanden och under proteasom hämning. Dessa profiler jämfördes de som erhålls för en immunoprecipitated ER-samband nedbrytning (ERAD) substrat. Våra resultat tyder på att de flesta NIH 3T3 cellulära glykoproteiner är relativt stabila och att de flesta av deras oligosackarider är trimmade till människan_9-8 GlcNAc₂. Däremot är instabila ERAD substrat trimmas till människan_6-5 GlcNAc₂ Och glykoproteiner med dessa arter samlas på hämning av proteasomal nedbrytning.

Protocol

Följande protokoll är avsedd för analys av socker kedjor av totalt glykoproteiner eller specifika glykoprotein av intresse. Förfarandet är i grunden densamma i båda fallen med några ändringar som anges hela protokollet. För metabola märkning av N-bundna glykaner man behöver använda en subconfluent kultur av däggdjursceller vuxit över natten i ett 90 mm maträtt för varje prov (prov kan representera olika tidpunkter eller behandlingar). Detta protokoll är optimerad för NIH 3T3 celler. <…

Discussion

Pulsen-jakt analys av glykaner i levande celler med HPLC separation ger en metod för att studera dynamiken i oligosackarid strukturella förändringar under hela livet för en glykoprotein. Det finns allt fler bevis för att sådana förändringar är involverade i att producera signaler för ER vikning, kvalitetskontroll och system för handel med ^2-5. Metoden kan tillämpas inte bara för ett specifikt glykoprotein av intresse, utan också för att analysera dynamiken i den struktur totala glykoproteiner, …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
600E Multisolvent delivery System controller		Waters	WAT062710
Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography)		Merck Bioscience	1.0003
Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30		Millipore	UFC503024 or 4208
Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor		Eppendorf	5301 000.016
Dialyzed Foetal Calf Serum		Biological Industries	04-011-1A
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium		Gibco Invitrogen Cell Culture	41965039
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – glucose free		Sigma-Aldrich	D5030
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)		Sigma-Aldrich	D1408
EDTA disodium salt (Titriplex Iii)		Merck	1084180250
Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)		New England Biolabs	p0703S
Foetal Calf Serum (FCS)		Biological Industries	04-001-1A
Frac-100 fraction collector		Amersham Biosciences	18-1000-77
LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems		Beckman Coulter	510720
Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol)		PerkinElmer Life Sciences	NET570A
N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132)		Calbiochem	474790
N-glycosidase F (1000 units/ml)		Roche	11365177
N-octylglucoside		Sigma-Aldrich	O3757
NIH 3T3 cells		American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1658
Opti-Flour		PerkinElmer Life Sciences	6013199
Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC)		Fluka	79607
Protease Inhibitor Cocktail		Sigma-Aldrich	P2714
Protein A-Sepharose beads		Repligen	IPA300
Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6
Sodium deoxycholate		Sigma-Aldrich	30970
Sodium dodecyl sulfate		Bio-RAD	161-0301
Sodium phosphate		Sigma-Aldrich	342483
Sodium pyruvate solution (100mM)		Sigma-Aldrich	S8636
Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm		Waters	PSS831115
Triton X-100		BDH	306324N
Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750		Sonics and Materials, Inc.	690-003
Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS
Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS
Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside
NIH 3T3 stably expressing H2a 6
Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS
Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS
2-mercaptoethanol		Sigma-Aldrich	M3148