Nous rapportons le développement d'un système automatisé pour l'imagerie et l'analyse des embryons de poisson zèbre transgénique dans des plaques multipuits. Ceci démontre la capacité de mesurer les effets dose-dépendante d'une petite molécule, la BCI, le Fibroblast Growth Factor expression du gène rapporteur et de fournir la technologie pour établir des écrans à haut débit chimiques du poisson zèbre.
Nous démontrons l'application de la base d'images à haute teneur de dépistage (HCS) une méthodologie pour identifier de petites molécules qui peuvent moduler la voie FGF / RAS / MAPK dans des embryons de poissons zèbres. L'embryon de poisson zèbre est un système idéal pour les écrans chimiques in vivo à haute teneur. L'embryon de 1 jour est d'environ vieille 1mm de diamètre et peuvent être facilement rangés dans des boîtes de 96 puits, un format standard pour le criblage haut débit. Durant la première journée de développement, les embryons sont transparents avec la plupart des principaux organes présents, permettant ainsi la visualisation de la formation des tissus durant l'embryogenèse. L'automatisation complète d'écrans chimiques poisson zèbre est toujours un défi, cependant, en particulier dans le développement de l'acquisition automatique d'images et d'analyse. Nous avons déjà généré une ligne journaliste transgénique qui exprime la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle de l'activité du FGF et démontré leur utilité dans les écrans chimiques<sup> 1</sup>. Afin d'établir une méthodologie pour les écrans à haut débit organisme tout entier, nous avons développé un système automatisé pour l'imagerie et l'analyse des embryons de poissons zèbres moins 24-48 heures après fécondation (HPF) en plaques de 96 puits<sup> 2</sup>. Dans cette vidéo, nous mettons en évidence les procédures d'rangeant embryons transgéniques en plaques multipuits à 24hpf et l'ajout d'une petite molécule (BCI) qui hyperactivates FGF de signalisation<sup> 3</sup>. Les plaques sont incubées pendant 6 heures, suivie par l'ajout de tricaïne pour anesthésier les larves avant d'imagerie automatisée sur un Molecular Devices ImageXpress Ultra confocale à balayage laser lecteur de HCS. Les images sont traitées par le logiciel Definiens Developer utilisant un algorithme de technologie Cognition réseau que nous avons développé pour détecter et quantifier l'expression de la GFP dans les têtes des embryons transgéniques. Dans cet exemple nous mettons en évidence la capacité de l'algorithme pour mesurer la dose-dépendante des effets de la BCI sur l'expression du gène rapporteur GFP dans les embryons traités.
Un des principaux facteurs limitant le débit d'écrans chimiques poisson zèbre est l'absence de méthodologie pour traiter systématiquement les plaques 96 puits pour l'imagerie et l'analyse. Parce que les images des organismes multicellulaires complexes, faible contraste, et de nature hétérogène, les algorithmes existants d'analyse d'image ne parviennent pas à détecter et quantifier des structures spécifiques au sein de l'organisme. La plupart des écrans chimiques publiée le poisson-zèbre donc impliquer un examen visuel de chaque puits par un personnel dévoué pendant toute la procédure. Cela empêche généralement la génération de lectures numériques et un archivage complet des images d'écran et les données. Par ailleurs, l'évaluation manuelle élimine plusieurs avantages clés de l'image basée sur le dépistage, à savoir la capacité d'effectuer des analyses rétrospectives de performances de l'écran, pour examiner les changements phénotypiques qui ne sont pas l'objectif principal de la campagne de dépistage (par exemple, la toxicité ou des anomalies du développement) et de traverser référence les données de dépistage avec des écrans passées ou à venir en utilisant la bibliothèque même composé.
Dans ce rapport, nous mettons en évidence la méthodologie pour l'imagerie automatisée et d'analyse des embryons de poissons zèbres en plaques multipuits, sans intervention de l'utilisateur. Nous capture d'image automatisée sur un laser ultra ImageXpress confocale à balayage lecteur (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) à l'image de Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embryons en plaques de 96 puits et développé un algorithme d'analyse d'images basée sur la technologie Definiens «Cognition réseau que la GFP quantifiés expression dans les têtes des embryons transgéniques. La méthode livré des réponses classées et quantifié l'activité in vivo d'une petite molécule d'activateur de FGF de signalisation. Des résultats similaires ont été obtenus avec la II épifluorescence basé ArrayScan (Cellomics Inc, Pittsburgh, PA) documentant qu'il est possible de mettre en oeuvre la capture d'image automatisée des embryons de poissons zèbres sur une variété de lecteurs de plaques disponibles dans le commerce 2. Le développement de la méthodologie pour analyser automatiquement les images organisme multicellulaire éliminé le besoin de notation visuelle par un observateur humain et a permis à la génération et l'archivage des données numériques et des images pour l'analyse rétrospective et des comparaisons avec des écrans de demain.
Ce travail est financé par le NICHD / NIH (1R01HD053287) pour Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) Vogt, et NHLBI / NIH (1R01HL088016) pour Tsang.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |