Summary
אנו מדווחים על פיתוח של מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של העוברים מהונדס דג הזברה בצלחות multiwell. זה מדגים את היכולת לאמוד את ההשפעות תלויות במינון של מולקולה קטנה, BCI, על גדילה פיברובלסטים ביטוי פקטור כתב גנים לספק טכנולוגיה להקמת תפוקה גבוהה כימיים מסכי דג הזברה.
Abstract
אנו להדגים את היישום של התמונה מבוססי מתודולוגיה גבוהה תוכן ההקרנה (HCS) כדי לזהות מולקולות קטנות שיכולות לווסת את מסלול FGF / RAS / MAPK עוברי דג הזברה. העובר דג הזברה הוא אידיאלי עבור מערכת ב-high-vivo תוכן מסכי כימיים. עובר יום 1 הישן הוא כ 1 מ"מ בקוטר יכול להיות ערוכים בקלות לתוך צלחות 96, טוב, פורמט סטנדרטי עבור הקרנת תפוקה גבוהה. במהלך היום הראשון של הפיתוח, עוברים הם שקופים עם רוב האיברים העיקריים הנוכחי, ובכך לאפשר הדמיה של היווצרות רקמות במהלך embryogenesis. אוטומציה מלאה של מסכי דג הזברה כימי הוא עדיין אתגר, לעומת זאת, במיוחד בפיתוח של רכישת התמונה ניתוח אוטומטי. אנחנו קודם שנוצר קו כתב מהונדס המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטה של פעילות FGF והפגינו השירות שלהם מסכי כימיים
Protocol
1) הגדרת הזדווגויות דג הזברה וטיפול BCI.
- יומיים לפני הטיפול, לזהות Tg זכר הומוזיגוטים (dusp6: d2eGFP) pt6 דג הזברה מקום בנפרד לתוך טנקים ההזדווגות 1. הוסף מפריד וסוג בר דגים AB * הנקבה ולהשאיר בכלובים ההזדווגות בין לילה.
- למחרת בבוקר להסיר מפריד, ולאסוף עוברים אחרי שעה 1. העברת עוברים למנות 100mm עם E3 (5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4), פתרון לדגור על 28 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות. הסר מתים מופרית עוברים, להוסיף פתרון E3 טריים, דגירה בין לילה.
- מיין מהונדס עוברים לשלב דומה (24hpf) והביטוי GFP אחידה. מערך עוברים בנפרד לתוך הבאר כל צלחת 96-היטב.
- הסר פתרון E3 עם עודף micropipette. הוסף 200μl של פתרון E3 עם pipettor רב ערוצי לתוך היטב כל אחד.
- מוסיפים את התרכובות הבאות כמפורט:
ריכוזים הסופי הם 1μM, 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI ב DMSO 1%. מכסים בנייר אלומיניום צלחת ו דגירה במשך 6 שעות 28 ° C.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2μl
DMSO2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
DMSOב 2μl
DMSO2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
DMSOג 2μl
DMSO2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
DMSOD 2μl
DMSO2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
DMSOE 2μl
DMSO2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
DMSOF 2μl
DMSO2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
DMSOG 2μl
DMSO2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mז)2μl
DMSOH 2μl
DMSO2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
Bcl
(0.1mm)2μl
Bcl
(0.5mm)2μl
Bcl
(1mm)2μl
Bcl
(2 מ"מ)2μl
Bcl
(2.5mm)2μl
DMSO
2) אוטומטי הדמיה של 96-היטב צלחות ניתוח.
- הוסף 10μl של tricaine (0.61mM) זה גם להרדים עוברים 30hpf.
- טען לתוך צלחת מולקולרית התקנים Imagexpress Ultra.
- פתח תוכנה Metaxpress. בחר תצורה עם מטרה 4x ואת קוטר חריר מקסימלית, להגדיר לייזר פוקוס אוטומטי לזהות תחתית צלחת, ולקבוע אופטימלי Z-המטוס כדי לזהות אזורים של עניין. לרכוש תמונות על עירור / פליטה באורכי גל של 488/525 ננומטר (GFP). הגדר לסרוק שטח כאתר יחיד של 2000x2000 פיקסלים (4 x 4 מ"מ) עם binning לא. הגדרת כוח לייזר ולהשיג כזו האזורים הבהירים בתמונות בקרה חיובית לא מרווה. אישור הרכישה תמונה נכונה בכמה בארות בקרה חיוביים ושליליים.
- התחל סריקה צלחת. המכשיר באופן אוטומטי לרכוש תמונות מכל הבארות וארכיון אותם נתונים של SQL Server.
- העלאת תמונות לתוך מפתחים Definiens באמצעות מודול יישום Cellenger ואת מסנן ייבוא שמכירה פורמט התמונה מבנה קובץ שנוצר על ידי פלטפורמת התקנים מולקולריים Ultra Imagexpress.
- תהליך תמונות עם אלגוריתם אישית מעוצבת Network Technology קוגניציה (שמכונה גם ruleset). האלגוריתם, אשר אנו מותאם אישית שפותחה על בסיס ruleset שפורסם לאחרונה 2, נועד לזהות באופן אוטומטי העובר, חלמון, והראש, לכמת את הבהירות לאזור ה-GFP-לבטא מבנים הראש. וולס שבו אין העובר מזוהה או שבו ראש לא ניתן להקצות באופן חד משמעי (למשל, עם רעילות גבוהה או מחוץ למתחם של תמונות מוקד) אינם נכללים בניתוח. הגדר את האלגוריתם באמצעות כמה תמונות בקרה שלילית (הרכב מטופל) ותמונות בקרה חיובית (BCI מטופלים) כזה ראש חלמון מזוהים כהלכה בשני. הגדר "מבנים ראש" זיהוי סף כמו בכפולות של עוצמת חלמון אומר עד לגילוי של מבנים ראש בהיר תואם תצפית ויזואלית. הגדרת פרמטרים לייצא. בדוגמה זו, פרמטר אינפורמטיבי ביותר היה בהירות משולב הכולל של ה-GFP חיובי אזורים בתוך הראש, המכונה להלן "ראש הכולל מבנים בהירות" (איור 1).
איור 1
גרף depicitng ההשפעות תלויות במינון של BCI על ביטוי של GFP בעוברים מהונדס. - הפעל את האלגוריתם על כל התמונות צלחת באמצעות מתזמן עבודה משולבת. התוכנה משתמשת Definiens מחשוב מבוזר על כמה מעבדים ("מנועי"), דבר המאפשר ניתוח סימולטני של מספר רב של תמונות. האלגוריתם מחשב את צעדי מספריים על סמך תוצאות מתוך ניתוח התמונה, אשר נשמרים במסד הנתונים יחד עם עותק של התמונה מעובד, עם ניתוח מיושם.
נציג תוצאות:
אחרי כל התמונות מנותחות, נתונים ניתן דמיינו בתוך Cellenger או מיוצא תוכנות צד שלישי (Excel, GraphPad פריזמה) עבור ניתוח נוסף ייצוג גרפי. איור 2 מראה בארכיון לסרוק תמונות מרכב מטופלים BCI-יחס טוב, עם או בלי ניתוח CNT מיושם. איור 1 מסמכים השפעה תלוית מינון של BCI על ביטוי גנים GFP כתב Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 עוברים. הריכוז הדרוש לתגובה מקסימלית וחצי (EC50) היה כ 12 מיקרומטר. 
איור 2
תמונה ללכוד ניתוח אוטומטי של העוברים דג הזברה מהונדס. (א) הרכב מטופל DMSO Tg (dusp6: d2eGFP) pt6 העובר על 30hpf. (ב) עוברים טראנסגנטי שטופלו להראות BCI 20μM עליות ביטוי של GFP. (ג) תמונה של העובר מן (א) לאחר הפעלת Definiens ruleset למצוא ביטוי של GFP בראש. כתמים כתומים מציינים שם תוכנה האמצעים עוצמת ה-GFP. (ד) העובר מקדימה של מ (ב ') לאחר שרץ Definiens ruleset למצוא ביטוי של GFP בראש. כתמים כתומים מציינים שם תוכנה האמצעים עוצמת ה-GFP. שים לב ruleset הצליח למצוא באזור המורחב של ה-GFP ביטוי בעובר טיפול.
Discussion
הגורם העיקרי המגביל את התפוקה של מסכי דג הזברה כימיים היא חוסר מתודולוגיה לתהליך שיטתי 96-גם צלחות עבור הדמיה וניתוח. בגלל תמונות של אורגניזמים תאיים הם בניגוד מורכבים, נמוך, הטרוגנית בטבע, קיים ניתוח אלגוריתמים התמונה מצליחים לזהות ולכמת מבנים ספציפיים בתוך האורגניזם. רוב שפורסם כימיים מסכי דג הזברה ולכן כרוך בדיקה ויזואלית של בארות הפרט על ידי אנשי מוקדש בכל ההליך. בדרך כלל זה מונע את הדור של readouts מספרית מוחלטת בארכיון של תמונות מסך ונתונים. יתר על כן, הערכה ידנית מבטלת יתרונות מרכזיים של ההקרנה מבוססות תמונה, כלומר את היכולת לנהל ניתוח רטרוספקטיבי של ביצועי המסך, כדי לבחון שינויים פנוטיפי שלא היו המוקד העיקרי של הקמפיין ההקרנה (למשל, רעילות או ליקויים התפתחותיים) ו לחצות הפניה ההקרנה נתונים עם מסכי בעבר או בעתיד באמצעות ספריה המתחם זהה.
בדו"ח זה אנו מדגישים מתודולוגיה הדמיה ניתוח אוטומטי של עוברי דג הזברה בצלחות multiwell ללא התערבות המשתמש. אנחנו ללכוד תמונה אוטומטית על לייזר ImageXpress Ultra סריקה confocal הקורא (התקנים מולקולריים, Sunnyvale, CA) לתמונה Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 עוברים 96 צלחות היטב פיתחה אלגוריתם עיבוד תמונה מבוסס על טכנולוגיה "Definiens רשת קוגניציה כי GFP לכמת ביטוי את ראשיהם של עוברי מהונדס. השיטה מועברת התגובות מדורגים לכמת בפעילות vivo של מולקולה קטנה activator של FGF איתות. תוצאות דומות התקבלו עם epifluorescence מבוססי ArrayScan II (Cellomics Inc, פיטסבורג רש"פ) המתעדים כי ניתן ליישם לכידת תמונה אוטומטי של עוברי דג הזברה על מגוון רחב של קוראי צלחת זמינים מסחרית 2. פיתוח המתודולוגיה באופן אוטומטי לנתח תמונות אורגניזם רב לבטל את הצורך הבקיע חזותי על ידי הצופה האדם ואפשרה את הדור בארכיון של נתונים מספריים תמונות לניתוח רטרוספקטיבי השוואות עם מסכי בעתיד.
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי NICHD / NIH (1R01HD053287) כדי Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) כדי ווגט, NHLBI ו / NIH (1R01HL088016) כדי צאנג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (MS222) | Sigma-Aldrich | Cat.# A-5040 |
References
- Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).
- Vogt, A. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).
- Molina, G. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).
