Wir berichten über die Entwicklung eines Systems zur automatisierten Abbildung und Analyse von Zebrafisch-transgenen Embryos in Mikrotiterplatten. Dies demonstriert die Fähigkeit, dosisabhängige Wirkung eines kleinen Moleküls, BCI, auf Fibroblast Growth Factor Expression des Reportergens zu messen und Technologie für den Aufbau High-Throughput-Zebrafisch chemische Bildschirme.
Wir demonstrieren die Anwendung der Image-basierten High-Content-Screening (HCS)-Methode, um kleine Moleküle, die Modulation der FGF / RAS / MAPK-Weg kann in Zebrafisch-Embryonen zu identifizieren. Der Zebrafisch Embryo ist ein ideales System für In-vivo-High-Content-chemischen Bildschirme. Die 1-Tage alten Embryo ist ca. 1mm im Durchmesser und lässt sich einfach in 96-Well-Platten, ein Standardformat für das Hochdurchsatz-Screening angeordnet werden. Während der ersten Tage der Entwicklung, sind Embryonen transparent mit den meisten der wichtigsten Organe vorhanden, so dass Visualisierung von Gewebe-Bildung während der Embryogenese. Die vollständige Automatisierung der Zebrafisch-chemischen Bildschirmen ist immer noch eine Herausforderung, aber vor allem in der Entwicklung von automatisierten Bildaufnahme und-analyse. Wir zuvor generierte eine transgene Reporter Linie, grün fluoreszierende Protein (GFP) bringt unter der Kontrolle von FGF-Aktivität und demonstriert deren Nutzen in der chemischen-Bildschirme<sup> 1</sup>. Um festzustellen, Methodik für hohen Durchsatz gesamten Organismus Bildschirme, entwickelten wir ein System für die automatisierte Abbildung und Analyse von Zebrafisch-Embryonen bei 24-48 Stunden nach der Befruchtung (HPF) in 96-Well-Platten<sup> 2</sup>. In diesem Video stellen wir die Verfahren für Anordnen transgenen Embryonen in Mikrotiterplatten bei 24hpf und die Zugabe eines kleinen Moleküls (BCI), dass FGF-Signale hyperactivates<sup> 3</sup>. Die Platten werden für 6 Stunden durch die Zugabe von Tricaine Larven vor Automated Imaging auf einem Molecular Devices ImageXpress Ultra-Laser-Scanning-konfokale HCS Leser betäuben gefolgt inkubiert. Die Bilder werden von Definiens Developer-Software mit einer Cognition Network Technology Algorithmus, die wir entwickelt, um nachzuweisen und zu quantifizieren Expression von GFP in den Köpfen der transgenen Embryos verarbeitet. In diesem Beispiel heben wir die Fähigkeit des Algorithmus, um eine dosisabhängige Wirkung von BCI auf GFP Reportergen-Expression in den behandelten Embryonen zu messen.
Ein wesentlicher Faktor, der den Durchsatz von Zebrafisch-chemischen Bildschirmen ist der Mangel an Methoden zur systematischen Prozess 96-Well-Platten für die Bildgebung und Analyse. Weil Bilder von vielzelligen Organismen komplexer, geringem Kontrast sind und heterogener Natur, nicht vorhandenes Bild-Analyse-Algorithmen zur Detektion und Quantifizierung spezifischer Strukturen innerhalb des Organismus. Die meisten veröffentlichten Zebrafisch chemische Bildschirme sind daher mit visuellen Prüfung der einzelnen Vertiefungen durch engagierte Mitarbeiter während des gesamten Verfahrens. Normalerweise verhindert die Erzeugung von numerischen Anzeigen und eine vollständige Archivierung der Bildschirm Bilder und Daten. Darüber hinaus entfällt die manuelle Auswertung einige wesentliche Vorteile von image-based Screening, das heißt die Fähigkeit, retrospektive Analysen von Screen-Performance durchzuführen, um phänotypische Veränderungen, die nicht der primäre Fokus des Screening-Kampagne (zB Toxizität oder Entwicklungsstörungen) zu untersuchen und Kreuz -Referenz-Screening-Daten mit Vergangenheit oder Zukunft Bildschirme mit der gleichen Verbindung Bibliothek.
In diesem Bericht haben wir Highlight Methodik zur automatisierten Abbildung und Analyse von Zebrafisch-Embryonen in Mikrotiterplatten ohne Eingreifen des Benutzers. Wir automatisierte Bildaufnahme auf einem ImageXpress Ultra-Laser-Scanning-konfokale (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), um Bild Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 Embryonen in 96-Well-Platten und entwickelte eine Bildanalyse-Algorithmus auf Definiens Cognition Network Technology, die quantifiziert GFP basiert Ausdruck in den Köpfen der transgenen Embryos. Die Methode geliefert abgestuften Antworten und quantifiziert die in-vivo-Aktivität eines kleinen Moleküls Aktivator von FGF-Signalisierung. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der Epifluoreszenz-basierte ArrayScan II (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) erhalten zu dokumentieren, dass es möglich ist, automatisierte Bildaufnahme von Zebrafisch-Embryonen auf eine Vielzahl von kommerziell erhältlichen Platereader 2 getroffen haben. Die Entwicklung von Methoden zur automatischen Analyse vielzelligen Organismus Bildern eliminiert die Notwendigkeit für die visuelle Scoring durch einen menschlichen Beobachter und aktiviert die Generierung und Archivierung von numerischen Daten und Bilder für retrospektive Analysen und Vergleiche mit Zukunft Bildschirme.
Diese Arbeit wird durch die NICHD / NIH (1R01HD053287) zu Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039), um Vogt und NHLBI / NIH (1R01HL088016) zu Tsang finanziert.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |