조직이 슬라이드에서 볼 수 준비 colonoscope는 항문을 통해 대장으로 전달이 가능합니다. colonoscope은 조명과 머리에 비디오 카메라를 가지고 긴 튜브이고, 능력은 콜론보다 시각화 수 있도록 긴 풍선처럼 날려 버릴 결장에 공기를 통과하고, 수 생검 포셉을위한 통로를 가지고하는 우리에게 생검 표본을 제공하기 위해 안쪽 표면에 "스킨"또는 콜론의 점막 층의 3-5mm 지역을 공략하기 위해 비디오 카메라를 넘어 확장. 생검 포셉도 잠재적으로 결장에서 발견 사전 암의 폴립을 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 정보의 동의, 환자에서 정상 colonic 점막 조직의 biopsies을 획득하였습니다. 이러한 환자는 위장병 클리닉에서 심사 결장경 검사법을 겪고 있었다. 우리 biopsies는 포르말린의 항아리에 배치했다. 사시간 후, 포르말린은 70 % 알코올로 대체되었습니다. 조직의 비슷한 샘플이 1cm와 10cm 거리에 고급 neoplasia과 결장 암 또는 adenomas에서 있었다 수술하는 동안 제거 결장 resections의 분야에서 찍은. 이 조직 샘플도 포르말린에 배치되었고, 조직 샘플이 큰라면, 일부는 70 % 알콜에 배치되기 전에 이상 기간 동안 포르말린에 보관했다. 조직 샘플은 처리 및 파라핀 블록에 배치되는에 대한 조직학 연구소로 이동합니다. 파라핀 블록은 그들보다 쉽게 마이크로톰로 절단하기 위해 냉장고에 차게됩니다. 4 마이크론 두께의 조직 섹션은 마이크로톰을 사용하여 조직 블록에서 절단하고, 물에 떠내려 있습니다. 이 슬라이드의 각 세 조직이 섹션이 때까지 인스턴스 ERCC1 및 Pms2 위해 두 단백질의 표현을 비교 들어, 다른 조직 섹션은 두 개의 슬라이드로 데리러 수 있습니다. 예를 들어, 섹션 1, 3, 5 ERCC1과 섹션 2, 4, 6 Pms2 표시된 슬라이드에 삽입할 수 표시 슬라이드에 둘 수 있습니다. 세 조직 섹션은 단일 슬라이드 한 단백질에 대한 immunostained 것은 아티팩트가 슬라이드에 하나 이상의 조직 섹션에서 반복되지 않을부터 토굴의 이상한 얼룩 패턴이 유물하거나 실제인지 볼 수 있습니다. 콜른 crypts 약 15 조직 섹션 하나의 토굴을 통해자를 수, 같은 토굴가 슬라이드마다 여러 조직 섹션에서 볼 수 있도록, 직경 약 60 미크론입니다. 조직 섹션을 Immunostaining 슬라이드는 다음 immunohistochemical 분류 절차를 통해 부착 할 것입니다. 이것은 8 시간 과정이며, 매우 표준입니다. 표준 없습니다 우리가 사용하는 절차의 부품, 얼룩에 대한 Sequenza 컨테이너의 사용이며, "스나이퍼"라는 배경 얼룩을 줄일 수있는 솔루션 중 하나를 사용하십시오. "스나이퍼"솔루션은 Biocare 의료, 콩코드 CA에 의해 독점적인 공식으로 판매됩니다. 우리의 절차의 단계 중 일부는 여기에 표시됩니다. 예를 들어, Pms2 immunohistochemistry를 위해, 슬라이드는 95 % 에탄올 2 변화 (2 분 뒤에 100 % 에탄올 2 변화 (2 분마다), 다음 크실렌 3 변화 (3 분마다)에 배치하여 첫번째 deparaffinized 아르 각), 증류수 2 변경 (2 분마다)으로 따라갔다. 실험자이 증기에 노출되지 않도록이 절차는 부정적인 공기 압력과 화학적 후드 아래에 진행됩니다. 처음 조직을 수정하는 데 사용되었을 때 포르말린, 조직 샘플에서 단백질의 일부는 교차 연결되었다. 이제 우리는 항체가 관심의 단백질을 인식할 수 있도록 상호 링크를 휴식해야합니다. 슬라이드는 전자렌지에서 물에 뛰어든다면 버퍼 솔루션에 배치됩니다. 이것은 매체 설정 10 분 뒤에이야, 빙판에 20 분 동안 냉각로 따라갔다. 이 단계는 좋은 결과를 얻을 때까지, 다른 전자 레인지에 대해 테스트하고 조정해야합니다. CcOI 또는 Ku86를 immunostaining을 위해 우리가 9mL 구연산 산성 + 41mL 나트륨 구연 산염에 대해 6.0의 산도를했다 ERCC1 위해 우리가 만든 구연 산염 버퍼를 사용하여 + 450mL H 2 O (나트륨 이온을 포함하여 버퍼)로 만든 나트륨 구연 산염 버퍼를 사용합니다 2.1g 구연산 산성과 + 1리터 H 2 O + ~ 5mL 나트륨 6.1 (최소한의 추가 나트륨 이온과 버퍼)에 산도를 가지고 수산화 및 Pms2을 위해 우리는 5mL 항원 Unmasking 솔루션 (벡터로) + 533mL로 만든 솔루션을 사용 H 2 O. 다른 버퍼는 특정 단백질과 항체 epitopes 상호 작용을 높이기 위해 필요합니다. 슬라이드는 다음 3 분 증류수로 씻어하고, 5 분 (PBS라고도 함) 인산 버퍼 호수에 씻은 다음 20 분 3 % 과산화수소 (메탄올에 희석)에 부착 할 것입니다. 슬라이드는 다음 Sequenza (써모 과학에서 쉔던 Sequenza의 Immunostaining 시스템)라는 평면 좁은 얼룩 랙에에 배치하고 PBS로 씻어서 있습니다. ERCC1 또는 Pms2에 대한 immunostained되는 슬라이드 그런 다음 10 분에 노출되는배경 단백질이 아닌 구체적인 얼룩을 줄이는 행위 '스나이퍼'라는 Biocare에서 얻은 독점적인 솔루션, 3 방울의 추가 치료에 노출 백인 군대가. 슬라이드는 1 ML 트윈 + 100 ML 10X 트리스 + 900 ML 증류수입니다 [10X 트리스는 24.2 g Trizma + 80g NaCl + 1,000 ML 증류수 및 탈이온수 + 집중 HCL (어디에 버퍼 "TBST"로 씻어서 아르 약 15 ML)는 산도 7.6]에 대한 해결책을 가지고 있습니다. 슬라이드가 다음 버퍼로 세 번 씻어서하고, DAKO 100 microliters은 1:100 희석 (버퍼 TBST에서 만든 2퍼센트 소 혈청 알부민의)에서 이차 항체를 biotinylated 아르 것은 슬라이드에 추가하고 실온에서 30 분 incubated입니다. 이 시점에서, Vectastain ABC (아비딘 비오틴 복합) (벡터 연구소에서) 시약은 2.5 ML PBS, 1 드롭 솔루션, 1 드롭 솔루션 B를 사용하여 준비하고, 솔루션은 30 분 동안 서 허용됩니다. 슬라이드는 TBST 버퍼와 3 번 씻어서 있습니다. 다음 Vectastain ABC 시약 3 방울 추가되고 슬라이드가 TBST로 2 번 rinsing 다음, 30 분 동안 상온에서 incubated입니다. 슬라이드는 다음 약 5 분 DAB (diamino – benzamide) (2.9 ML DAB + 400 microliters PBS + 250 microliters의 과산화수소)에 열중하고 있습니다. 슬라이드는 다음 증류수, 탈이온수 2 번 씻어서 있습니다. Counterstaining 10 초 동안 hematoxylin의 희석 용액과 함께 이루어집니다. 슬라이드는 탈이온수 다음 수돗물로 깨끗이 씻어서 있습니다. 슬라이드 다음 95 % 에탄올에 2 분, 100 % 에탄올 2 분 크실렌 2 분 2 회 2 번 탈수 2 배입니다. Cytoseal XYL (리차드 – 앨런 과학)의 방울의 몇 가지는 다음 슬라이드에 추가하고 coverslip이 적용됩니다. ERCC1, Ku86과 CcOI의 Immunohistochemical 평가 Pms2과 동일한 프로토콜을 사용하여 수행하지만, ERCC1, Ku86과 CcOI에 대한 항체로 Pms2 항체를 교체 아래 표에 설명되어 있습니다. ERCC1 표현에 결함 crypts, Pms2, Ku86과 CcOI에 대한 조직 섹션을 평가 우리는 colonic 점막의 crypts에 Pms2과 ERCC1의 표현 Motic (DM – BA300) photomicroscope에 따라 조직 섹션에서 최초 것입니다. Pms2과 ERCC1 모두 DNA 수리 효소 있으며, DNA가 어디 그래서 그들은 crypts의 세포의 핵에 위치하고 있습니다. 이것은 ERCC1에 대한 얼룩을 대표하는 브라운 콜론, 토굴에서 세포의 핵에서 발생 그림 1에 표시됩니다. 우리가 현미경에 처음 표시 일반 토굴은 ERCC1에 대한 스테인드, 그리고 갈색 얼룩이 ERCC1의 위치를 보여줍니다되었다. 우리는, "고블렛 세포"가 지하실의 바깥에있는 세포의 바닥에 작은 지역에서 핵으로 다소 와인 유리 모양의 crypts, 그리고 ballooning 섹션 밖에서 세포의 유형을 지적 지하실 안쪽에있는 세포의 부분에 흰색 mucin의 과립으로 가득. 세포의 다른 두 종류의 스테인드 섹션에 비슷하게 다소 보면, 그들은 enterocytes 및 enteroendocrine 세포이며, 그 핵은 세포의 기본에, 지하실의 바깥쪽 가장자리도 있습니다. 여기에 같이 colonic neoplasia 없었 환자, 또는 멀리 결장암의 사이트에서 biopsies에서 찍은 biopsies에서 거의 모든 모든 crypts의 핵 중 ERCC1 표현의 정상적인 높은 수준을 보여줍니다. 동양없이 colonic neoplasia 환자의 biopsies에서 얻은 우리의 관찰, 조직 섹션 정상 colonic 점막에 Pms2 표현의 수준 ERCC1, CcOI 또는 Ku86에 대해 관찰하고 있습니다. 우리가 천천히 crypts, 간질성 세포, 슬라이드의 모든 림프 nodules, 그리고 muscularis 밖으로 전체 조직 섹션 및 지점 통과로 우리는 (40x 목적 렌즈와 정상 조직 섹션에있는 모든 crypts을 볼 수있는 경우 생검에서). 우리는 또한 줄기 세포의 지하실 바닥에 단지 몇 가지 세포가있다는 것을 지적. 이러한 줄기 세포는 전체 지하실의 약 2,000 세포를 모두 생성합니다. 돌연변이 또는 epimutation있는 줄기 세포는 전체 줄기 세포 틈새 이상 걸릴 수 있습니다. 그런 다음 전체 토굴 우리가 CcOI 높은 표현을 crypts 옆에 CcOI에 대한 결함 전체 crypts를 참조하십시오 어디서 우리가이 새 슬라이드보기로 관심 효소 (토굴 변환)에 대한 얼룩 변경될 수 있습니다. 그렇다면 우리는 결장암 또는 고급 neoplasia과 adenoma있는 환자에서 슬라이드를 표시합니다. 이 슬라이드에 일부 crypts은 ERCC1에 대한 표현의 정상적인 높은 수준을 가지고 있으며 일부는 표현의 낮은 수준을했습니다. 조직 섹션 내에서 crypts 모든 10X 목적 렌즈와 낮은 해상도로 촬영하고, 전체 조직 섹션 하나의 이미지에서 볼 수 있습니다 있도록 이미지 타일입니다. crypts 그런 다음 번호가 있습니다. 멀리 서있는 biopsies에서 crypts 전형적인 효소의 높은 표정으로 crypts,m 모든 암은 레벨 "4"얼룩이라고합니다. 감지 아무런 표현이없는 경우 살짝만 감지 표현이 분명있다면 다른 수준, "1"을 "0"입니다, "2"는 표현이 선물이있다면,하지만 훨씬 낮은 수준 4보다 수준 및 "3"의 표현이있다면 4보다 낮은 수준에서 존재하지만, 상당히 강한. 우리는 2 노란색, 3 녹색 주황색 1과 0에 대한 적색, 4에 대한 낮은 해상도 이미지 파랑의 각 슬라이드를 점. 여기 40x 목적 렌즈를 사용하여 조직 검사에서 섹션을 통해가는 보여줍니다. 우리는 낮은 해상도 이미지에 crypts을 점. 그림 1. 지하실 세포의 핵에서 ERCC1 높은 표현을 보여주는 colonic 토굴. 이 이미지의 모든 색상은 동일 페인트 샵 프로 5를 사용하고, 명암과 채도의 향상되었다. 대표 결과 별도의 슬라이드에 다른 조직 섹션은 우리가 immunohistochemistry으로 표시된 두 개의 서로 다른 단백질의 표정으로, 동일한 colonic crypts 볼 수 있습니다. ERCC1 한 Pms2에 대한 토굴 자국과 같은 토굴 자국의 이미지가 인접한 컴퓨터 모니터 옆에 현미경에 표시됩니다. 이것은 우리가 공동 결핍은 각 자주있는 동안, 독립적으로 발생하는 두 단백질 또는 단백질의 각 결함 여부가 있는지 확인할 수 있습니다. 우리는 단백질의 표현에 명백한 결핍이 유물로 인해 하나 이상의 섹션에 결함되고, 그리고으로 확인할 수 있도록 슬라이드 지당 3 조직 섹션이 있습니다. 암에 상승을주는 현장 결함이 결장 암을 주변 조직에서 ERCC1 및 Pms2에 대한 결함 crypts의 고주파가 있습니다. 우리는 또한 Ku86과 CcOI에 대한 결함 crypts의 빈도를 찾을 수 immunohistochemistry를 사용했습니다. 이 슬라이드에, 우리는 전체 조직 섹션 40x 목적 렌즈를 사용하여, Ku86에 대한 immunostained 통과하고, 우리는 몇 가지 crypts이 조직 섹션에서 Ku86에 대한 결함이있다는 것을 알 수 있습니다. 마찬가지로,이 슬라이드에, 우리는 전체 조직 섹션 40x 목적 렌즈를 사용 CcOI에 대한 immunostained 통과, 우리는 crypts만을 적당한 숫자가 CcOI에 대한 결함이있다는 것을 알 수 있습니다.