Preparar tecidos para ser visualizado em slides A colonoscópio pode ser passado para o cólon através do reto. A colonoscópio é um tubo longo que tem iluminação e uma câmera de vídeo na cabeça, a capacidade de passar o ar para dentro do cólon para explodi-lo como um balão longo para permitir uma melhor visualização do cólon, e tem uma passagem para a pinça de biópsia que pode vão além da câmera de vídeo para beliscar fora de uma área de 3-5 milímetro da superfície interna "pele" ou camada mucosa do cólon para nos dar uma amostra da biópsia. A pinça de biópsia também pode ser usado para remover potencialmente pré-cancerosas pólipos encontrados no cólon. Obtivemos biópsias de cólon normal de tecidos de mucosa de pacientes, com o consentimento informado. Esses pacientes foram submetidos a uma colonoscopia em uma clínica gastrointestinal. Nosso biópsias foram colocados em frascos de formol. Após 4 horas, o formol foi substituído por álcool 70%. Amostras semelhantes de tecido foram retiradas de áreas de ressecções do cólon, removido durante a cirurgia, que foi de 1 cm e 10 cm de distância do câncer de cólon ou adenomas avançados com neoplasia. Estas amostras de tecido foram colocados em formol, e se as amostras de tecido foram grandes, alguns foram mantidos em formalina, por um longo período antes de serem colocados em álcool 70%. As amostras de tecido são levados para um laboratório de histologia para ser processado e colocado em blocos de parafina. Blocos de parafina são refrigerados no frigorífico para torná-los mais facilmente cortado por um micrótomo. Cortes de tecido de 4 de espessura micron são cortados a partir dos blocos de tecidos, utilizando um micrótomo, e flutuou sobre a água. Para comparar a expressão de duas proteínas, por exemplo ERCC1 e PMS2, cortes de tecido alternativo pode ser pego em dois slides, até há três cortes de tecido em cada uma das duas lâminas. Por exemplo, seções 1, 3 e 5 pode ser colocado em uma lâmina rotulados ERCC1 e seções 2, 4 e 6 pode ser colocado em uma lâmina rotulados PMS2. Com três cortes de tecido histoquímica para uma proteína em um único slide pode permitir que você veja se um padrão de coloração incomum de uma cripta é um artefato ou é real, já que os artefatos não seria repetido em mais de uma secção de tecido em um slide. Criptas do cólon são cerca de 60 mícrons de diâmetro, de modo que cerca de 15 secções de tecido pode ser cortado por meio de uma cripta, ea cripta mesmo poderia ser visto em várias secções de tecido por slide. Imunocoloração secções de tecido Os slides são então colocados através do procedimento de imunohistoquímica. Este é um procedimento de oito horas, e é bastante normal. As peças do procedimento que usamos, que não são normais, são o uso de recipientes Sequenza para a coloração, eo uso de uma solução para reduzir a coloração de fundo chamado de "Sniper". O "Sniper" solução é vendida como uma fórmula patenteada pela Biocare Medical, Concord CA. Alguns dos passos dos nossos procedimentos são mostrados aqui. Como exemplo, para PMS2 imunohistoquímica, as lâminas são primeiro desparafinizadas colocando em 3 mudanças de xileno (3 minutos cada), seguidos por 2 mudanças em etanol 100% (2 minutos cada), seguidos por 2 mudanças em etanol 95% (2 minutos cada), seguidos de 2 mudanças de água destilada (2 minutos cada). Estes procedimentos são realizados sob um capuz químico com pressão negativa, para que o pesquisador não é exposto aos vapores. Quando formol foi inicialmente utilizada para fixar o tecido, peças das proteínas na amostra de tecido tornou-se cross-linked. Agora, precisamos quebrar as ligações cruzadas de modo que um anticorpo capaz de reconhecer a proteína de interesse. Os slides são colocados em uma solução tampão que é trazido a uma fervura em forno de microondas. Isso é seguido por 10 minutos na configuração média, seguido de resfriamento por 20 minutos no gelo. Esta etapa precisa ser testado e ajustado para micro-ondas diferentes, até que bons resultados são alcançados. Note-se que para a imunocoloração CCOI ou Ku86 usamos um tampão citrato de sódio feito com ácido cítrico 9ml + citrato de sódio 41mL + 450ml H 2 O (incluindo um buffer de íons de sódio), que tinha um pH de cerca de 6.0, para ERCC1 usamos um tampão citrato feitas com ácido cítrico 2.1g + 1 litro H 2 O + ~ 5mL de hidróxido de sódio para trazer o pH para 6,1 (um buffer com o mínimo de íons de sódio adicionado), e para PMS2 usamos uma solução feita com uma solução de 5 mL Antígeno Unmasking (por VECTOR) + 533mL H 2 O. Buffers diferentes são necessários para aumentar a interação de anticorpos com epítopos de proteína particular. Os slides são então colocados em peróxido de hidrogênio 3% (diluída em metanol) por 20 minutos seguido por uma lavagem em água destilada por 3 minutos, e lavadas em tampão fosfato (chamado PBS) por 5 minutos. Slides são então colocados em flat racks coloração estreito chamado Sequenza (Shandon Sistema de imunocoloração Sequenza Thermo Scientific) e lavados com PBS. Os slides sendo histoquímica para ERCC1 ou PMS2 são expostos então a 10 minutes exposição a um tratamento adicional de 3 gotas de uma solução proprietária, obtido a partir Biocare, chamado de "Sniper" que atua para reduzir a coloração não específica de proteínas de fundo. Os slides são lavados com um buffer "TBST", que é de 1 ml + 100 ml Tween 10x Tris + 900 ml de água destilada [onde Tris 10x é 24,2 gramas Trizma + 80 gramas NaCl + 1000 ml de água destilada e deionizada + HCl concentrado (cerca de 15 ml) para trazer a solução para pH 7,6]. Slides são então lavadas três vezes com tampão, e 100 microlitros de DAKO anticorpo secundário biotinilado na diluição 1:100 (em 2% albumina bovina composta em tampão TBST) é adicionado aos slides e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente. Neste ponto, Vectastain ABC (Avidin Biotina Complexo) (a partir Vector Laboratories) reagente é preparado, usando 2,5 ml de PBS, uma solução de queda A, 1 B solução drop, ea solução é deixada em repouso por 30 minutos. As lâminas são lavadas 3 vezes com tampão TBST. Em seguida, 3 gotas de reagente Vectastain ABC é adicionado e as lâminas são incubadas em temperatura ambiente por 30 minutos, seguido de lavagem 2 vezes com TBST. Slides são, então, imerso em DAB (diamino-benzamida) (2,9 ml DAB + 400 + 250 microlitros PBS o peróxido de hidrogênio microlitros) por cerca de 5 minutos. Slides são então lavados duas vezes com água destilada deionizada. Contracoloração é feito com uma solução diluída de hematoxilina por 10 segundos. Slides são lavados cuidadosamente em água da torneira, seguida de água deionizada. Slides são então desidratado 2 vezes por 2 minutos em etanol 95%, 2 vezes por 2 minutos em etanol 100% e 2 vezes por 2 minutos em xileno. Um par de gotas de Cytoseal XYL (Richard Allan-Científica) são então adicionados aos slides e uma lamela aplicada. Avaliação imunohistoquímica de ERCC1, Ku86 e CCOI são realizadas usando o mesmo protocolo para PMS2, mas substituindo o anticorpo PMS2 com anticorpos para ERCC1, Ku86 e CCOI descritos na tabela abaixo. Avaliar cortes de tecidos para criptas deficiente na expressão de ERCC1, PMS2, Ku86 e CCOI Vamos primeiro olhar para cortes de tecidos sob um fotomicroscópio (DM-BA300) Motic à manifestação de PMS2 e ERCC1 em criptas da mucosa do cólon. PMS2 e ERCC1 são enzimas de reparo de DNA, e assim eles estão localizados onde o DNA é, no núcleo das células das criptas. Isto é indicado na Figura 1, onde os dois pontos marrons representam coloração para ERCC1, ocorre no núcleo das células em uma cripta. A cripta normal, primeiro show no microscópio estava manchada de ERCC1, ea mancha marrom mostra a localização dos ERCC1. Destacam-se os tipos de células nas criptas, onde "células caliciformes" são forma semelhante a uma taça de vinho, com núcleos em uma pequena região na base das células na borda exterior da cripta, e um balão para fora seção, repletas de grânulos de mucina branco na parte da célula no interior da cripta. Os outros dois tipos de células olhar um pouco parecidos em nossos cortes corados, e eles são os enterócitos e células enteroendócrinas, e seus núcleos também estão na borda exterior da cripta, na base das células. Em biópsias de pacientes que nunca tiveram uma neoplasia do cólon, ou em biópsias longe de qualquer local do câncer de cólon, quase todos os núcleos em todas as criptas mostrar alto nível normal de expressão de ERCC1 como mostrado aqui. Para orientar nossas observações, cortes de tecidos obtidos de biópsias de pacientes com neoplasia do cólon não são observados os níveis de expressão de PMS2, ERCC1, CCOI ou Ku86 na mucosa do cólon normal. Podemos observar todas as criptas em uma secção de tecido normal, com uma lente objetiva de 40x, como nós lentamente passar por uma secção de tecido inteiro e apontar as criptas, as células intersticiais, qualquer nódulos linfóides no slide, e os muscularis (se houver na biópsia). Destacamos ainda, que há apenas várias células na base da cripta, que são as células-tronco. Essas células-tronco geram todos os cerca de 2.000 células da cripta completa. Uma célula-tronco com uma mutação ou um epimutation pode assumir o nicho inteiro com células-tronco. Em seguida, a cripta todo pode ter alterado a coloração de uma enzima de interesse (conversão crypt) como mostramos neste novo slide onde vemos criptas todo deficiente para CCOI ao lado de criptas que têm alta expressão de CCOI. Então, vamos mostrar um slide de uma paciente com câncer de cólon ou um adenoma com neoplasia avançada. Neste slide, algumas criptas têm elevado nível normal de expressão para ERCC1 e alguns têm níveis mais baixos de expressão. Todas as criptas dentro da secção de tecido são fotografados em baixa resolução com uma lente objetiva de 10x, e as imagens são revestidas de modo que a secção de tecido inteiro é visto em uma imagem. As criptas são então numerados. As criptas com alta expressão da enzima, típico de criptas em biópsias longe from qualquer tipo de câncer, são chamados de coloração nível "4". Outros níveis são "0" se não existe uma expressão detectável, "1" se a expressão apenas mal detectável é evidente, "2" se houver um presente de expressão, mas a um nível muito mais baixo do que o nível 4, e "3" se a expressão é presentes em um nível inferior a 4, mas bastante forte. Nós dot cada slide sobre o azul de baixa resolução de imagem para quatro, laranja verde para 3, amarelo para 2, para 1 e vermelho para 0. Aqui nós mostramos passando por uma seção de uma biópsia usando uma lente objetiva de 40x. Nós dot criptas na imagem de baixa resolução. Figura 1. A cripta do cólon mostrando alta expressão de ERCC1 nos núcleos das células da cripta. Todas as cores nesta imagem foram igualmente reforçada em contraste e saturação, usando o Paint Shop Pro 5. Resultados representante As secções de tecido alternativo em slides separados permitem-nos olhar para as criptas mesmo do cólon, com expressão de duas proteínas diferentes demonstrado por imunohistoquímica. A imagem de uma cripta para PMS2 manchado e manchado a cripta mesmo para ERCC1 é mostrado em microscópios adjacentes com monitores de computador adjacentes. Isso nos permite determinar se há carência conjunta de duas proteínas, ou se as deficiências em cada uma das proteínas, enquanto cada um é freqüente, ocorre de forma independente. Temos três cortes de tecido por lâmina, de modo que qualquer deficiência aparente na expressão de uma proteína pode ser verificado como sendo deficiente em mais de uma seção, e não devido a um artefato. Em tecidos circundantes cancros do cólon, onde há um defeito de campo que deu origem ao câncer, há uma alta freqüência de criptas deficiente para ERCC1 e PMS2. Temos também utilizado imunohistoquímica para encontrar a frequência das criptas para deficientes Ku86 e CCOI. Neste slide, passamos por uma secção de tecido toda histoquímica para Ku86, usando uma lente objetiva de 40x, e podemos ver que algumas criptas são deficientes para Ku86 nesta seção tecido. Da mesma forma, neste slide, passamos por uma secção de tecido toda histoquímica para CCOI, usando uma lente objetiva de 40x, e podemos ver que apenas um número moderado de criptas são deficientes para CCOI.