Summary
Ein analytischer Arbeitsablauf, der auf Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) basiert, für eine hochzuverlässige und hochgradig reproduzierbare "Bottom-up"-Analyse von Histonmodifikationen und -identifizierung basierend auf Hauptparametern (Retentionszeit [RT], Kollisionsquerschnitt [CCS] und genaues Masse-zu-Ladungs-Verhältnis [m/z]).
Abstract
Histonproteine sind bei Eukaryoten sehr häufig und konserviert und spielen aufgrund von Strukturen, die als posttranslationale Modifikationen (PTMs) bekannt sind, eine große Rolle bei der Genregulation. Die Identifizierung der Position und Art jedes PTMs oder Musters von PTMs in Bezug auf externe oder genetische Faktoren ermöglicht es, diese Informationen statistisch mit biologischen Reaktionen wie DNA-Transkription, Replikation oder Reparatur zu korrelieren. In der vorliegenden Arbeit wird ein Hochdurchsatz-Analyseprotokoll für den Nachweis von Histon-PTMs aus biologischen Proben beschrieben. Der Einsatz von komplementärer Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) ermöglicht die Trennung und PTM-Zuordnung der biologisch relevantesten Modifikationen in einer einzigen Analyse. Der beschriebene Ansatz nutzt die jüngsten Entwicklungen in der abhängigen Datenerfassung (DDA) mit paralleler Akkumulation in der Mobilitätsfalle, gefolgt von sequentieller Fragmentierung und kollisionsinduzierter Dissoziation. Histon-PTMs werden basierend auf ihrer Retentionszeit, Mobilität und ihrem Fragmentierungsmuster sicher zugewiesen.
Introduction
In eukaryotischen Zellen wird DNA als Chromatin in funktionelle Einheiten verpackt, die Nukleosomen genannt werden. Diese Einheiten bestehen aus einem Oktamer von vier Kernhistonen (je zwei von H2A, H2B, H3 und H4)1,2,3,4. Histone gehören zu den am häufigsten vorkommenden und am höchsten konservierten Proteinen in Eukaryoten, die maßgeblich für die Genregulation verantwortlich sind5. Posttranslationale Histonmodifikationen (PTMs) spielen eine große Rolle bei der Regulation der Chromatindynamik und steuern verschiedene biologische Prozesse wie DNA-Transkription, -Replikation und -Reparatur6. PTMs treten hauptsächlich auf der zugänglichen Oberfläche der N-terminalen Regionen von Histonen auf, die mit DNA in Kontakt stehen 3,7. Schwanz- und Kernmodifikationen beeinflussen jedoch die Chromatinstruktur, verändern die Internukleosomeninteraktionen und rekrutieren spezifische Proteine 3,8.
Eine aktuelle Herausforderung bei der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-basierten Proteomik ist die potenzielle Co-Elution von Analyten von Interesse. Bei datenabhängigen Analysen (DDA) bedeutet dies den potenziellen Verlust mehrerer Vorläuferionen während des MS/MS-Erfassungsprozesses9. Time-of-Flight (ToF)-Instrumente erfassen Spektren mit sehr hoher Frequenz 9,10 (bis zu zehn kHz)11; Dadurch sind sie in der Lage, die gesamten Vorläuferionen innerhalb einer komplexen Probe (MS1) schnell zu scannen, was eine optimale Empfindlichkeit und MS/MS-Sequenzierungsraten (bis zu 100 Hz)9 verspricht und sie ideal für die biologische Probenanalysemacht 10. Die Empfindlichkeit, die bei diesen hohen Scanraten verfügbar ist, ist jedoch durch die MS/MS-Rate9 begrenzt. Die Hinzufügung der Gefangenen-Ionen-Mobilitätsspektrometrie (TIMS) in Kombination mit einem orthogonalen Quadrupol-Flugzeitspektrometer (qToF) wurde verwendet, um diese Einschränkungen zu mildern. In TIMS werden alle Vorläuferionen im Tandem akkumuliert und in Abhängigkeit von ihrer Mobilität eluiert, anstatt einzelne Vorläufermassen mit einem Quadrupol9 auszuwählen. Die parallele Akkumulations-serielle Fragmentierung (PASEF) ermöglicht Hunderte von MS/MS-Ereignissen pro Sekunde ohne Verlust der Empfindlichkeit9.
Das Hauptziel dieser Arbeit war es, die jüngsten Entwicklungen der DDA unter Verwendung von paralleler Akkumulation in der Mobilitätsfalle, gefolgt von sequentieller Fragmentierung und kollisionsinduzierter Dissoziation (CID), aufzuzeigen. Histon-PTMs wurden basierend auf ihren Retentionszeiten (RTs), Mobilitäten und Fragmentierungsmustern sicher zugewiesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Histonproben wurden mit einer Methode extrahiert, die von Bhanu et al. (2020)12 übernommen wurde.
1. Probenvorbereitung
- Ernte von kultivierten Zellen
- Wenn Zellen zu 80 % konfluent sind, stellen Sie sicher, dass sie lebensfähig sind, indem Sie den Trypanblau-Ausschluss verwenden.
HINWEIS: Für diese Experimente wurde eine HeLa S3-Zelllinie verwendet, aber diese Methode kann auf alle kultivierten Zellen angewendet werden. - Aspirieren Sie das Medium und tragen Sie dann 5 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf jede Platte auf.
- Schwenken Sie die Platte(n), um alle Restmedien zu spülen, saugen Sie dann PBS an und tragen Sie 5 ml 1x PBS auf.
- Trennen Sie die Zellen vorsichtig von der Platte, indem Sie sie mit einem Einweg-Zellheber abkratzen.
- Jede Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen geben.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 800 x g für 5 min.
- Saugen Sie das PBS aus dem Zellpellet an.
- Fahren Sie mit der Histonextraktion fort.
HINWEIS: Schockfrosten Sie das Zellpellet in flüssigem Stickstoff, wenn es nicht sofort verarbeitet werden kann. Lagern Sie die Pellets bei -80 °C, bis Sie fortfahren können.
- Wenn Zellen zu 80 % konfluent sind, stellen Sie sicher, dass sie lebensfähig sind, indem Sie den Trypanblau-Ausschluss verwenden.
- Histon-Extraktion
- Schätzen Sie das Volumen jedes Zellpellets und markieren Sie den Meniskus mit einem Permanentmarker.
- Bereiten Sie genügend Kernisolationspuffer (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 und 250 mM Saccharose) für alle Proben vor. Wenn im Laufe der Zeit viele Proben verarbeitet werden müssen, können Sie den Puffer alternativ in loser Schüttung herstellen und bis zu 6 Monate bei 2-8 °C lagern oder aliquotieren und auf unbestimmte Zeit bei -15 °C bis -25 °C einfrieren, indem Sie nur die für jede Extraktion erforderliche Menge auftauen.
HINWEIS: Der Puffer sollte während der Lagerung frei bleiben. Wenn der Puffer zu irgendeinem Zeitpunkt trüb oder anderweitig abnormal aussieht, entsorgen Sie ihn und bereiten Sie frischen Puffer vor. - Bereiten Sie das 50-fache Volumen der Zellpellets des Waschpuffers vor und fügen Sie Inhibitoren wie folgt hinzu (ca. 10 ml Waschpuffer pro 2 Proben).
- Zur Herstellung von 10 ml Waschpuffer mischen Sie 10 ml NIB, 30 μl 200 mM 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluoridhydrochlorid [AEBSF], 10 μl 1 M Dithiothreitol [DTT], 20 μl 5 μM Microcystin, 20 μl 5 M Natriumbutyrat.
- Entfernen Sie 1/5 des Waschpuffers, um den Lysepuffer vorzubereiten (1/5 Volumen aus dem Waschpuffer, 0,3 % NP-40 oder NP-40 Alternative).
HINWEIS: Verwenden Sie Triton-X 100 nicht anstelle der Alternative NP-40 oder NP-40, da es für bestimmte Zelltypen zu abrasiv sein kann. - Waschen Sie das Zellpellet gründlich, indem Sie es in 5 Spalten Waschpuffer suspendieren und bei 800 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Führen Sie diesen Schritt zweimal aus, saugen Sie den Überstand zwischen den Wäschen an und entsorgen Sie ihn.
- Stellen Sie sicher, dass das Volumen des Zellpellets noch mit einem Permanentmarker markiert ist. In 10 Volumina Lysepuffer resuspendieren.
- Pipetten Sie jedes Pellet gründlich, um es zu resuspendieren, und inkubieren Sie es dann 15 Minuten lang auf Eis.
- Nach 15 min bei 800 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Saugen Sie den Überstand an und entsorgen Sie ihn.
Anmerkungen: Das Pellet sollte auf ≤ 1/2 der ursprünglichen Pelletgröße reduziert werden (wie durch die Markierungslinie angezeigt). Wenn das Pellet nicht ausreichend reduziert ist, wiederholen Sie den Lysevorgang und fügen Sie einen sanften Homogenisierungsschritt mit einem Stößel hinzu, um die Zellen aufzubrechen. - Nach Abschluss der Lyse wird das Pellet in 500 μl Waschpuffer resuspendiert und dann 5 Minuten bei 4 °C bei 800 x g zentrifugiert. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie dann den Waschschritt erneut, um alle Spuren von NP-40 zu entfernen.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt besteht das Pellet aus Chromatin, das Histone enthält. - Resuspendieren Sie das Pellet in 5 Volumina (der ursprünglichen Zellpelletgröße) von 0,4 N H2SO4.
- 2 h in einem Kühlraum oder Kühlschrank mit einem Rührwerk inkubieren.
- Nach 2 h zentrifugieren Sie die Probe(n) bei 3400 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand nicht.
- Übertragen Sie den Überstand in neue Röhrchen und spießen Sie 100% Trichloressigsäure (TCA) auf 1/3 des Volumens des Inhalts (die endgültige TCA-Konzentration beträgt ca. 20%).
- Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um und beobachten Sie, dass die klare, farblose Lösung weiß und/oder trüb wird, was auf Proteinausfällung hinweist.
HINWEIS: Bei Lösungen mit niedrigen Histonkonzentrationen ist die Proteinausfällung möglicherweise nicht sofort spürbar, aber der Niederschlag sollte nach der Inkubation über Nacht sichtbar sein. - Über Nacht (12-18 h) bei 4 °C ungestört inkubieren, um die Histonproteine vollständig auszufällen.
- Am nächsten Tag bei 3400 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Saugen Sie den Überstand an und achten Sie darauf, die Seiten des Röhrchens nicht mit der Pipettenspitze zu berühren. In diesem Stadium werden die Histone hauptsächlich als Film an den Seiten der Röhre(n) abgeschieden.
- Geben Sie 500 μl eiskaltes Aceton + 0,1 % HCl (saures Aceton) mit einer Pasteurpipette aus Glas in jedes Röhrchen und drehen Sie die Röhrchen mehrmals vorsichtig um. Ordnen Sie dabei die Proben in der Reihenfolge (1, 2, 3 usw.) an, da jedes fehlerhafte Aceton die Markierungen auf den Röhrchen entfernen kann. Bei 3400 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig dekantieren.
- Wiederholen Sie diesen Spülschritt mit 500 μl eiskaltem 100%igem Aceton, ebenfalls mit einer Pasteurpipette aus Glas. Bei 3400 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig dekantieren.
- Lassen Sie die Röhrchen offen bei Raumtemperatur trocknen, bis das restliche Aceton verdampft ist.
- Nach dem Trocknen 100 μl Wasser in Massenspektrometrie (MS)-Qualität in jedes Röhrchen geben. Verwenden Sie dieses Tröpfchen, um alle Seiten des Behälters abzutupfen, um den gesamten Histonfilm zu resuspendieren. Tun Sie dies, indem Sie das Tröpfchen auf die Seite des Röhrchens pipettieren und es drehen, während Sie auf und ab pipettieren, oder indem Sie die Hälfte der 100 μl abgeben und mit der Spitze rundherum umrühren. Eine Kombination beider Methoden funktioniert am besten. Histone sind leicht wasserlöslich und befinden sich in der Lösung.
- Nach dem Resuspendieren aller Proben, falls noch weiße Feststoffe vorhanden sind, 5 Minuten lang in einem Bad bei Raumtemperatur beschallen.
- Bei 800 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Übertragen Sie die klare Lösung auf frische Röhrchen. Entsorgen Sie alle verbleibenden unlöslichen Pellets.
- Führen Sie eine SDB-PAGE unter reduzierenden Bedingungen aus, um zu überprüfen, ob die Extraktion sauber ist.
HINWEIS: Gele können mit jeder geeigneten Konzentration von Polyacrylamid betrieben werden, solange Proteine im Bereich von 10-20 kDa unterschieden werden können. In der Materialtabelle finden Sie die in diesem Protokoll verwendeten Gele. - Führen Sie einen Proteinkonzentrationstest (d. h. Bradford oder BCA) durch, um die Gesamtproteinkonzentration zu bestimmen.
- Chemische Derivatisierung (Propionylierung) der Lysinreste
- 20 μg Histone (bestimmt durch den Protein-Assay) in ein sauberes Röhrchen geben. Trocknen Sie diese Probe mit einem Vakuumkonzentrator auf <5 μl und resuspendieren Sie sie dann mit 20 μl 100 mM Ammoniumbicarbonat (NH4CO3) (~1 μg/μl Lösung). Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit Ammoniumhydroxid auf ~8 ein.
ACHTUNG: Verwenden Sie Ammoniumhydroxid (NH4OH) nicht zur Resuspendierung, sondern nur zur Einstellung des pH-Werts, falls erforderlich. Andernfalls denaturieren Proteine und fallen aus.
HINWEIS: Um den pH-Wert mit minimalem Probenverlust zu überprüfen, tauchen Sie die Probe mit einer Pipettenspitze ein und tupfen Sie sie auf einen pH-Streifen. Dieses Testverfahren wird in den verbleibenden Schritten der Probenvorbereitung nützlich sein. - Bereiten Sie das Propionylierungsreagenz vor, indem Sie Acetonitril (ACN) im Verhältnis 1:3 (v/v) Propionanhydrid zusetzen (d. h. um 40 μl Reagenz herzustellen, kombinieren Sie 10 μl Propionanhydrid mit 30 μl ACN).
HINWEIS: Traditionell werden Methanol oder Isopropanol zur Herstellung eines Propionylierungsreagenzes verwendet. Da die Propionylierung eine Amidbildungsreaktion ist, ist ein nicht-protonisches Lösungsmittel wie Acetonitril erforderlich, um unerwünschte Nebenprodukte und Reaktionen wie Methylpropionylester zu verhindern, die bei der Verwendung von Methanol entstehen. Bereiten Sie nur genügend Propionylierungsreagenz für bis zu 4 Proben gleichzeitig vor, damit das Reagenz frisch bleibt. Verwenden Sie das Reagenz innerhalb von 1-2 Minuten nach der Zubereitung. Wenn das Reagenz sitzt, reagiert das Propionanhydrid mit Umgebungsfeuchtigkeit und es beginnt sich Essigsäure zu bilden, was die Wirksamkeit des Reagenzes verändern und den pH-Wert der Histonlösung ändern kann, sobald das Reagenz hinzugefügt wird. - Propionylierungsreagenz zu jeder Probe im Verhältnis 1:4 (v/v) geben (d. h. für 20 μl Histone 5 μl Propionylierungsreagenz hinzufügen).
- Fügen Sie schnell 1:5 (v/v) NH4OH hinzu (d. h. fügen Sie 4 μl für 20 μl der Histonlösung hinzu), um den pH-Wert der Lösung wieder auf ~8 zu bringen. Wenn der pH-Wert immer noch zu niedrig ist, fügen Sie jeweils 1-2 μl NH4OH hinzu, bis ein pH-Wert von 8 erreicht ist. In der Regel ist ein Verhältnis von 1:5 (v/v) ausreichend.
- Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang ungestört bei Raumtemperatur.
- Wiederholen Sie die Propionylierungsreaktion für nicht mehr als 3-4 Proben pro Charge des Propionylierungsreagenzes, um eine minimale Säurebildung zu gewährleisten.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2 bis 1.3.5 des Propionylierungsverfahrens. Eine zweite Runde der Propionylierung stellt sicher, dass >95% der verfügbaren Lysine derivatisiert werden.
- Trocknen Sie die Proben mit einem Vakuumkonzentrator auf <5 μl. Dadurch werden alle nicht umgesetzten Propionylierungsreagenzien, sauren Produkte und Ammoniakgas verdampft, die aus dem NH4OH freigesetzt werden. Wenn die Proben vollständig austrocknen, ist dies in Ordnung, da keine nennenswerten Probenverluste auftreten.
Anmerkungen: Verdrängen Sie vor der Lagerung die Luft in der Propionanhydridflasche mit Argongas, um die Bildung von Essigsäure durch Kontakt mit der in der Flasche verbleibenden Umgebungsfeuchtigkeit zu verhindern.
- 20 μg Histone (bestimmt durch den Protein-Assay) in ein sauberes Röhrchen geben. Trocknen Sie diese Probe mit einem Vakuumkonzentrator auf <5 μl und resuspendieren Sie sie dann mit 20 μl 100 mM Ammoniumbicarbonat (NH4CO3) (~1 μg/μl Lösung). Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit Ammoniumhydroxid auf ~8 ein.
- Proteolytischer Verdau mit Trypsin
- Resuspendieren Sie Histone in 100 mM NH4HCO3 , um ein Volumen von 20 μl zu erreichen und eine optimale Konzentration von 1 μg/μl zu erreichen.
HINWEIS: Probenlösungen mit Konzentrationen unter 1 μg/μl führen zu einer verminderten Trypsineffizienz. - Fügen Sie Trypsin zu Histonproben im Verhältnis 1:10 (Gew./Wt) hinzu (d. h. fügen Sie 2 μl 1 μg/μl Trypsinlösung zu 20 μg Histone hinzu).
- Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 °C für 6-8 h. Alternativ über Nacht (12-18 h) bei Raumtemperatur inkubieren.
- Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie mindestens 1 h bei -80 °C einfrieren.
HINWEIS: Verwenden Sie keine Säure, um die Verdauungsreaktion zu löschen, da dies zu diesem Zeitpunkt des Verfahrens zu einem unerwünschten Abfall des pH-Werts führt. Die Probe kann bei -80 °C gelagert werden, bis sie fortgefahren werden kann (Zwischenstopp).
- Resuspendieren Sie Histone in 100 mM NH4HCO3 , um ein Volumen von 20 μl zu erreichen und eine optimale Konzentration von 1 μg/μl zu erreichen.
- Chemische Derivatisierung (Propionylierung) von Peptid-N-Terminoren
- Trocknen Sie die Proben mit einem Vakuumkonzentrator auf <5 μl.
- Resuspendieren Sie die Proben bis zu 20 μl (1 μg/μl) mit 100 mM NH4HCO3.
- Wiederholen Sie die Propionylierung wie zuvor (Schritt 1.3).
HINWEIS: Es ist normal, dass die Proben bei diesem Schritt aufgrund eines höheren Verhältnisses von wässriger zu organischer Phase länger zum Trocknen brauchen.
- Probenentsalzung mit Stufenspitzen
- Resuspendieren oder verdünnen Sie die Proben mit 50 μl MS-Wasser + 0,1 % TFA.
- Stanzen Sie mit einem 11-G-Probencorer 5 Scheiben mit C18-Material aus einer Festphasenextraktionsscheibe (stanzen Sie alle 5 Scheiben, bevor Sie sie in die Pipettenspitze übertragen). Setzen Sie die Scheiben ein und stellen Sie sicher, dass sie sicher und gleichmäßig an der Unterseite einer 200-μl-Pipettenspitze verkeilt sind (Abbildung 1).
HINWEIS: Verwenden Sie einen 15-G-Entkerner, wenn Sie mehr als 25 μg Probe durch eine einzelne Stufenspitze entsalzen. - Verwenden Sie einen Zentrifugenadapter, um die Tischspitzen in 1,5-ml- oder 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu halten.
Anmerkungen: Verwenden Sie für die folgenden Zentrifugationsschritte eine langsame (400-500 x g) Umdrehung bei 4 °C für jeweils 1-2 Minuten; die Lösungsmittel passieren das Harz normalerweise in weniger als 1 Minute, je nachdem, wie dicht das C18-Material in den Spitzen verpackt ist. - Spülen Sie das Harz durch Zentrifugieren mit 50 μl 100% Acetonitril, um das C18-Material zu aktivieren und potenzielle Verunreinigungen zu entfernen.
HINWEIS: Es kann einfacher sein, Lösungen mit Gellade-Pipettenspitzen auf die Tischspitzen zu laden. Nach der Aktivierung des C18-Materials ist es wichtig, das Harz für die Dauer des Entsalzungsvorgangs nicht austrocknen zu lassen. - Äquilibrieren Sie das Scheibenmaterial mit 80 μl Wasser in MS-Qualität + 0,1 % TFA durch Zentrifugation.
- Säuern Sie die Probe mit Eisessig auf pH 4 oder niedriger an. Überprüfen Sie den pH-Wert wie zuvor mit pH-Streifen, um den Probenverlust zu minimieren.
- Laden Sie die gesamte Probe durch langsame Zentrifugation auf die Harzscheibe.
- Waschen Sie die Probe mit 80 μl MS-Wasser + 0,1 % TFA durch Zentrifugation.
- Eluieren Sie die Probe in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen, indem Sie 70 μl 75 % Acetonitril und 0,5 % Essigsäure durch langsame Zentrifugation spülen. Zusätzliche Zentrifugationszeit kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass das gesamte Probenvolumen von der Tischspitze eluiert wird. Es ist in Ordnung, wenn das Harz mit der zusätzlichen Zentrifugationszeit austrocknet, da es nach der Elution der Probe nicht mehr benötigt wird.
- Trocknen Sie jede Probe vollständig in einem Vakuumkonzentrator.
HINWEIS: Proben(en) können bei -80 °C gelagert werden, bis sie fortgefahren werden können (Zwischenstopp). - Für die LC-MS/MS-Analyse rekonstituieren Sie die Proben in einem Volumen Lösungsmittel A (0,1 % Ameisensäure) aus dem Flüssigkeitschromatographieprotokoll (LC), das die Endkonzentration von 0,4 μg/μl ergibt (d. h. 20 μg Histone in 50 μl Lösungsmittel A auflösen).
2. TIMS-Software-Schnittstelle
- Wählen Sie die Registerkarte Instrument, und wechseln Sie zu Operate (vergewissern Sie sich, dass der Instrumentenname grün hervorgehoben wird) (Abbildung 2).
- Überprüfen Sie die TIMS-Parameter (Abbildung 2).
- Überprüfen Sie die MS-Einstellungen (Scanbeginn, Scan-Ende, Ionenpolarität, Scan-Modus) (Abbildung 2).
- Überprüfen Sie die TIMS-Einstellungen (Modus, Mobilitätsstart, Mobilitätsende, Rampenzeit, Akkumulationszeit, Tastverhältnis, Rampenrate, MS-Rate, MS-Mittelwertbildung und Autokalibrierung) (Abbildung 2).
- Gehen Sie zur Registerkarte Quelle und aktivieren Sie die Spritzenoption (Hamilton 500 μl) nur für den TuneMix-Kalibrierungsschritt (Abbildung 3)13.
- Gehen Sie zur Registerkarte Kalibrierung , klicken Sie auf m/z, wählen Sie Kalibrierungsmodus und wählen Sie den Modus (Enhanced Q, allgemein), zoomen (+0,01%) STD Dev (0,24) und klicken Sie auf Kalibrieren; Wenn eine Punktzahl von 100 % erreicht wird, akzeptieren Sie (Abbildung 4).
- Gehen Sie zur Registerkarte Mobilität und wiederholen Sie den Kalibrierungsvorgang (im Allgemeinen Linearmodus), den Erfassungsbereich (+5%), die Breite (0,1 Da), die STD-Entwicklung (0,1855) und klicken Sie dann auf Kalibrieren; Wenn Sie eine Punktzahl ≥ 98,5 % erhalten, akzeptieren Sie (Abbildung 5).
- Gehen Sie zur Methode und wählen Sie die zu verwendende Methode aus. für dieses Beispiel wurde Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl ausgewählt (Abbildung 5).
3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS
- Verwenden Sie die typischen nESI-Betriebsbedingungen: 4500 V Kapillarspannung, 800 V Endplattenversatz, 3,0 bar Verneblerdruck, 10,0 l/min Trockengas, 200 °C Trockenheizung und 50 μl/min Einspritzdurchflussrate.
- Verwenden Sie die typischen MS-Einstellungen: 6 eV Kollisionsenergie, 1200 Vpp Kollisions-HF, 75 μs Übertragungszeit, 5 μs Vorimpulsspeicherung.
- Bestimmen Sie den Treibgasstrom anhand der Druckdifferenz zwischen dem Eintrittstrichter P1 und dem Austrittstrichter P2. In der TIMS-Zelle findet eine parallele Akkumulations-serielle Fragmentierung (PASEF) statt, bei der alle Vorläuferionen gleichzeitig und nicht einzeln akkumuliert werden. Vorläuferionen werden dann in schmalen Ionenpeaks im Vergleich zu den normalerweise viel breiteren Peaks (etwa 50-mal kürzer) freigesetzt, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wird, während gleichzeitig co-eluierende Peptide über Mobilität getrenntwerden 14.
- Entwicklung einer LC-TIMS-ToF MS/MS-Methode zur Analyse proteolytischer Histonpeptide. Koppeln Sie einen Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC) mit einer C18-Säule (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) mit einem kommerziellen TIMS-TOF-MS-Gerät mit proprietärer PASEF-Technologie.
HINWEIS: Diese Säulengröße wurde basierend auf zuvor veröffentlichten Arbeiten15, 16, 17 so bestimmt, dass sie sowohl bei hohem als auch bei niedrigem pH-Wert eine gute Trennung für Peptidmischungen bietet.- Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 20 μl (8 μg) Probe und eine Flussrate von 0,4 ml/min ein.
- Führen Sie einen 60-minütigen, nichtlinearen LC-Gradienten mit Wasser mit 0,1 % Ameisensäure (Lösungsmittel A) und Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure (Lösungsmittel B) durch. Stellen Sie die Steigung ein: 10 % B für 2,7 min, dann auf 20 % B in 5,3 min, 28 % B in 4 min, 35 % B in weiteren 18 min, auf 40 % B in 13 min und 100 % B in weiteren 2 min. Nachdem Sie 5 Minuten lang 100 % B gehalten haben, senken Sie die Konzentration in 5 Minuten auf 10 % B und halten Sie sie für die letzten 5 Minuten.
- Verifizieren Sie die Probenelution von der HPLC in das TIMS-TOF über Nano-Elektrospray-Ionisation (nESI) im positiven Ionisationsmodus.
4. Datenanalyse
- Identifizieren Sie die Peptidsequenzen und Modifikationsstellen.
- Erstellen Sie eine theoretische Liste von Peptiden mit ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] unter dem MS-Digest-Tool.
- Führen Sie einen theoretischen Verdau unter Berücksichtigung der Bedingungen des Verdaus (verwendetes Enzym), der gesuchten PTM-Typen (z. B. Mono-, Di- oder Trimethylierung), des Größenbereichs der gesuchten Peptide sowie des Massennachweisbereichs und der potenziellen Anzahl übersehener Spaltungen durch.
- Erstellen Sie eine theoretische Liste von Peptiden mit ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] unter dem MS-Digest-Tool.
- Analysieren Sie die erfassten Daten manuell auf der Grundlage theoretischer Peptide (Abbildung 6)12.
- Suchen Sie nach den Massen bei mehreren Ladungszuständen (+1 bis +4) für jedes theoretische Peptid.
- Nach der anfänglichen Identifizierung jedes m/z wählen Sie den Peak aus und bestätigen Sie die MS/MS anhand einer theoretischen Liste von Fragmentierungsionen basierend auf der Peptidsequenz, einschließlich PTMs.
HINWEIS: Wenn die Mobilität des identifizierten Peptids zuvor bekannt war, wird dies ebenfalls bestätigt.
- Berechnen Sie die relativen Häufigkeiten verschiedener PTMs und melden Sie jede Modifikation als Prozentsatz der angegebenen Peptidsequenz.
- Die relative Häufigkeit jedes detektierten PTM wird anhand der folgenden Gleichung berechnet:
Relative Abundanz = PTM-Fläche/Gesamtfläche von unmodifizierten und PTMs für ein gegebenes Peptid
- Die relative Häufigkeit jedes detektierten PTM wird anhand der folgenden Gleichung berechnet:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ein Bottom-up-Proteom-Workflow (Abbildung 7) umfasst in der Regel Folgendes: Extraktion des Zielproteins aus einer Rohprobe, gefolgt von der Quantifizierung der Konzentration des Proteins/der Proteine und der anschließenden Fraktionierung, in der Regel durch Gelelektrophorese oder Flüssigkeitschromatographie. Nach der Fraktionierung werden die Proteine mit einem proteolytischen Enzym (oft Trypsin) verdaut und schließlich eine massenspektrometrische Analyse der resultierenden Peptide und eine Proteinidentifizierung unter Verwendung einer etablierten Datenbank18. Die Sequenzinformationen werden von Vorläuferionen innerhalb des angegebenen Masse-zu-Ladungs-Bereichs (m/z) abgeleitet, die einer kollisionsinduzierten Dissoziation (CID) ausgesetzt sind, wodurch Fragmentierungsmuster erzeugt werden, die mit Hilfe einer Datenbank identifiziert und sequenziert werdenmüssen 19 (Abbildung 8).
Für diese Arbeit bestand das Hauptziel darin, eine LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA-Methode zu entwickeln und anzuwenden, die den zuvor im Protokollabschnitt beschriebenen Schritten folgt. Die Bestimmung der Positionalität posttranslationaler Modifikationen an isomeren und isobaren Peptiden stellte eine besondere Herausforderung bei der Identifizierung und Spektreninterpretation dar. In dieser Studie wurden rekombinante humane Histonstandards und HeLa S3-Zellen als Proben verwendet.
Die Histon-PTM-Analyse menschlicher Histonstandards mittels ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS ergab mittelgroße bis große Peptide (3-30 Aminosäuren Länge), die mit bis zu 5 Ladungen pro Peptid nachgewiesen wurden. Das Propionylierungsverfahren war erfolgreich bei der Herstellung längerer, informativerer Peptide als die, die üblicherweise durch den tryptischen Verdau hergestellt werden. Bei der Datenanalyse wurden Peptide in unterschiedlich modifizierten Zuständen identifiziert. Als Vorteil unterschied die TIMS-basierte Methode einige positionsisomere Peptide, die die gleichen PTMs tragen. Zum Beispiel können sich zwei isomere Spezies in der Retentionszeit und m/z überlappen; die beiden Signale konnten jedoch im Mobilitätsbereich getrennt werden (Abbildung 9).
Die entsprechenden Fragmentierungsspektren für die in Abbildung 9 gezeigten Peptide wurden von einer Proteomanalysesoftware unter Verwendung der entsprechenden FASTA-Dateien annotiert. In Abbildung 9A ist das unmodifizierte Peptid mit drei Propionylgruppen (+56,03) (auf dem N-Terminus, Lysin 18 und Lysin 23) zu sehen. In Abbildung 9B ist das Peptid mit einer Acetylgruppe (+42,02) auf Lysin 18 und zwei Propionylgruppen (eine am N-Terminus und eine auf Lysin 23) zu beobachten. Schließlich ist in Abbildung 9C das Peptid mit einer Acetylierung an Lysin 23 und zwei Propionylgruppen (an der N-terminalen und Lysin 18) zu sehen. Wie bereits veröffentlicht, könnte der PASEF-Vorteil genutzt werden, um die Sequenzierungsgeschwindigkeit und -empfindlichkeit zu erhöhen, indem dasselbe Merkmal wiederholt anvisiertwird 9. Dies ermöglicht es dem Benutzer, mehr Strukturinformationen aus biologischen Proben zu gewinnen. In diesem Fall wird dies auf die Art und Position der PTMs angewendet, die auf jedem Histon auftreten.
Die posttranslationale Modifikationsanalyse kann auch visuell als Sequenzabdeckungsdiagramm dargestellt werden, wie in Abbildung 10 zu sehen ist. In Abbildung 10A weist der Histon-H3-Standard, der vor dem Verdau propionyliert wurde, längere Peptide auf, als es sonst der Fall gewesen wäre, was durch die blauen Linien gekennzeichnet ist. Histone, die aus HeLa S3-Zellen extrahiert wurden, wurden auf die gleiche Weise verarbeitet, wie in Abbildung 10B dargestellt. Es wurden mehrere PTMs angezeigt, darunter viele verschiedene Muster an denselben Aminosäurepositionen. Dies ist bei biologischen Proben zu erwarten. Bemerkenswert ist, dass die wenigen grauen Linien in Abbildung 10B Peptide kennzeichnen, die aufgrund des Fehlens eines MS2 aufgrund der geringen Intensität mehrdeutig identifiziert wurden.
Abbildung 1: Schematische Darstellung und Herstellung von Tischspitzen. (A-G) Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Herstellung einer C18-Siliziumdioxid-Scheibentischspitze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Datenverarbeitung: 20210804 Propionylierte Standard-Histone Mix_QC Peptid. Bevor Sie mit der Verarbeitung der Daten beginnen, stellen Sie sicher, dass Sie die theoretische Liste der möglichen Ladungszustände und ihrer Fragmentierungen (1550.9013; 775.9543; 517.6386; usw.) erstellen, um diese Werte aus dem Basis-Peak-Chromatogramm (BPC +All MS) zu extrahieren. Stellen Sie nach dem Extrahieren jedes Peptids sicher, dass es wie in der Abbildung gezeigte Analyseliste aussieht. Als Beispiel wurde der Höchststand von 775,9543 ausgewählt. Auf der rechten Seite der Abbildung sind drei Diagramme dargestellt: Das erste entspricht dem Chromatogramm (Intensitäts-Zeit-Diagramm), das zweite dem Mobilogramm und das dritte dem Massenspektrum mit PASEF-Fragmentierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: timsControl-Protokollschritte 1-4. Die Abbildung zeigt die ersten vier Schritte des timsControl-Verfahrens. Klicken Sie oben links auf die Schaltfläche Instrument , um die Verbindung zwischen dem Instrument und der Software ein- und auszuschalten. Vor dem Ausführen einer Aufgabe muss sichergestellt werden, dass sich die Software im Betriebsmodus befindet. Überprüfen Sie abschließend, ob die TIMS-Parameter korrekt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Quellparameter. In diesem Fall wurde die Spritze Hamilton 500 μL nur für TuneMix verwendet. Stellen Sie sicher, dass die anderen Parameter korrekt bleiben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Kalibrierung von Masse zu Ladung (m/z). Wählen Sie Kalibrieren , bis eine Punktzahl von 100 % im Kalibrierungsmodus unten links erreicht wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Kalibrierung der Mobilität. Wählen Sie Kalibrieren , bis eine Punktzahl von mindestens 98,5 % im Kalibrierungsmodus unten links erreicht wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Typischer Bottom-up-Proteomik-Workflow. Schritt-für-Schritt-Verfahren von der Probenvorbereitung bis zur Identifizierung9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Retentionszeit, Isotopenmuster und H3 18-26-Mobilitätsprofile. (A) Unmodifiziert propionyliert, (B) K23Ac-Peptid propionyliert in den anderen beiden Positionen und (C) K18Ac propionyliert in den anderen beiden Positionen. Beachten Sie die Vorteile der Mobilitätstrennung für den Fall der in den Feldern B und C gezeigten Strukturisomere. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Beispiel für eine MS/MS-Fragmentierungspeptidsequenzierung mit PASEF. Fragmentspektren wurden aus einer Proteomanalysesoftware für das H3-Peptid mit den Aminosäurepositionen 18-26 erhalten. (A) unmodifiziert propionyliert, (B) K23Ac-Peptid propionyliert in den anderen beiden Positionen und (C) K18Ac propionyliert in den anderen beiden Positionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Beispiel für eine Zusammenfassung der visuellen Histon-PTM-Analyse. Ergebnisse der beobachteten Peptide und PTMs aus (A) einem H3-Standard und (B) H3 aus HeLa S3-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Standard- und HeLa S3-Peptid-LC-TIMS-ToF-MS/MS-Eigenschaften. Ziel- und beobachtete Peptidliste, einschließlich experimenteller Eigenschaften (d. h. Retentionszeit, m/z, 1/Ko und LC-Peakbereiche). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histone sind grundlegende Proteine, die die Chromatinstruktur regulieren, indem sie mit der DNA in Form von Oktameren interagieren, die aus den vier Kernhistonen (je zwei von H2A, H2B, H3 und H4) bestehen20. Histone enthalten zahlreiche Lysin- und Argininreste, die leicht modifiziert werden können, was zu umfangreichen PTMs führt, die die Chromatinchemie verändern, indem sie die Histonfunktion beeinflussen oder an andere zelluläre Proteine binden21. PTMs können biologische Reaktionen hervorrufen, indem sie zusammenarbeiten, wobei bestimmte Gruppen von PTMs bei mehreren Krankheiten, insbesondere bei mehreren Krebsarten, berichtet wurden22.
Wenn DNA-Schäden auf zellulärer Ebene erkannt werden, folgt sofort die Wirkung einer komplexen Signalkaskade, bei der Läsionen markiert werden, gefolgt von der Koordination des Zellzyklusverlaufs und der Aktivierung der erforderlichen Reparaturwege. Darüber hinaus induziert DNA-Schädigung verschiedene Modifikationen wie Acetyl- und Methyladdukte, die die Proteinrekrutierung erleichtern23. Die große Vielfalt an PTMs, die an DNA-Läsionen beteiligt sind, führt zu der Frage, wie diese molekularen Mechanismen ihre Koexistenz regulieren und welche funktionelle Bedeutung es hat, die Integrität des Genoms durch ein äußerst komplexes integriertes Netzwerk zu verteidigen. Zum Beispiel wurde die Lysin-9-Trimethylierung von Histon H3 (H3K9me3) mit verschiedenen Pathologien bei verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht24. Aus solchen Gründen ist es notwendig, instrumentelle Analysemethoden zu entwickeln, die eine vollständige Charakterisierung dieser Modifikationen auf zellulärer Ebene ermöglichen23.
Die Analyse der HeLa S3-Histonextraktionen mit manueller Datenanalysesoftware und Proteomanalysesoftware ergab PTMs, einschließlich Acetylierung (+42,01 Da), Methylpropionylierung (+70,04 Da), Dimethylierung (+28,03 Da) und Trimethylierung (+42,05) für mehrere Histonproteine. Darüber hinaus konnte die PASEF-basierte MS/MS-Methode einige positionsisomere Peptide unterscheiden, die die gleichen PTMs tragen.
In der Einleitung werden die Vorteile der Kopplung von LC-TIMS-ToF MS/MS bei der Untersuchung von PTMs kurz beschrieben, um die jüngsten Entwicklungen von DDA unter Verwendung paralleler Akkumulation in der Mobilitätsfalle gefolgt von sequentieller Fragmentierung und kollisionsinduzierter Dissoziation aufzuzeigen. Die Hauptidee besteht darin, eine Methodik zu etablieren, die die Auflösung von Signalen ermöglicht, die von verschiedenen Peptiden stammen und die klassische Techniken bisher nicht auflösen konnten. Der Derivatisierungsprozess mit Propionanhydrid verhindert die Spaltung von Lysin-C-Terminen durch Trypsin und erzeugt längere, informativere Peptide. Peptide mit der gleichen m/z - und Retentionszeit konnten anhand ihrer Fragmentierungsmuster identifiziert werden, aber es zeigte sich auch, dass einige dieser Spezies mit dieser LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS-Methode im Mobilitätsbereich getrennt werden konnten.
Um dies besser zu verstehen, stellt Abbildung 8 drei Hauptmerkmale eines Moleküls dar und ermöglicht so die Identifizierung einer Verbindung, unabhängig davon, ob es sich um intakte Proteine, Lipide oder Peptide (in diesem Fall Histon H3 18-26) handelt, um nur einige Beispiele zu nennen. Zu diesen Eigenschaften gehören die Verweilzeit (min) einer Verbindung in der chromatographischen Säule, das Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) jeder Verbindung und die Mobilität (1/Ko), die diese Verbindungen aufweisen, wenn sie mit dem Treibgas wechselwirken. In Abbildung 8A wird gezeigt, dass das unmodifizierte H3-Peptid 18-26 eine RT von 28,15 min aufweist und dass es zwei Banden in seinem Mobilitätsspektrum aufweist, was darauf hindeutet, dass es mindestens zwei Konformationen aufweist, ein Ergebnis, von dem vermutet wird, dass es ein Ergebnis der beiden Lysine (18 und 23) ist, die gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll propionyliert wurden. Die folgenden Spektren (Abbildung 8B,C) zeigen das gleiche Peptid (H3 18-26), variieren jedoch die Position der Acetylierungsgruppe (42.02) zwischen B, K18Ac und C, K23Ac. Diese beiden Isomere (K18Ac und K23Ac) wurden durch das Mobilogramm identifiziert, da sie unterschiedliche räumliche Verteilungen aufweisen, was zu unterschiedlichen Wechselwirkungen mit dem Gas in der TIMS-Zelle führt. Die Bedeutung dieser Methode liegt in der Möglichkeit, die verschiedenen PTMs, die mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht wurden, z. B. durch DNA-Schäden, zu identifizieren und genauer zu untersuchen.
Wenn die Fragmentierungsdaten spärlich sind, ist die Identifizierung einer Modifikation an einem bestimmten Rest eine Herausforderung, da zwei oder mehr unähnliche Modifikationen gleichzeitig an (oder in der Nähe) derselben Reste auftreten können und als eine einzige Modifikation verstanden werden können25. Dies könnte gelöst werden, indem sichergestellt wird, dass das unmodifizierte Peptid identifiziert wurde, insbesondere durch die Verwendung eines Standards zur Bestätigung oder Verneinung des Vorhandenseins einer einzelnen Modifikation anstelle mehrerer Modifikationen (Tabelle 1).
Um eine übermäßige Kontamination oder Extraktion von unreinen Histonen zu vermeiden, ist es wichtig, die Qualität der Reagenzien vor der Verwendung zu überprüfen. Wenn die NIB-Pufferlösung beispielsweise in großen Mengen gelagert und verwendet wird, stellen Sie sicher, dass die Lösung klar ist und keine äußerliche Trübung oder abnormale Präsentation aufweist. Trübung kann das Ergebnis von Bakterienwachstum sein, das Proben kontaminieren und zu einer Mischung aus Histonen und bakteriellen Proteinen führen könnte. Darüber hinaus wird empfohlen, neue Kalibrierungskurven für Assays zu erstellen, wie z. B. den BCA- oder Bradford-Assay zur Bestimmung der Proteinkonzentration, um sicherzustellen, dass das für die Kalibrierungskurve verwendete Protein nicht abgelaufen oder abgebaut ist.
Diese Methode kann auf andere Arten von Zellen oder Organismen ausgeweitet werden, zum Beispiel auf Mücken. Bei ganzen oder teilweisen Organismen ist die Auswahl einer geeigneten Anzahl von Organismen besonders wichtig, um sicherzustellen, dass die endgültige Histonkonzentration für die Analyse geeignet ist.
Als allgemeine Richtlinie für die Wartung von Massenspektrometern sollte das vordere Ende regelmäßig gereinigt werden, um Ablagerungen auf dem Gerät und Verunreinigungen zwischen den Läufen zu vermeiden. Diese Reinigung sollte je nach Bedarf den Vorhang, die Blende und den Quadrupol umfassen.
Im Allgemeinen ist es bei der Verwendung eines LC notwendig, jede Woche frische mobile Phase(n) mit Lösungsmitteln in MS-Qualität vorzubereiten. Es empfiehlt sich, spezielle Pipetten und Glaswaren für die mobile Phasenvorbereitung aufzubewahren und die LC-Leitungen zu spülen, wenn neue Lösungen auf das System gelegt werden. Schutz- und Trennsäulen sollten in der Regel alle 100-200 Injektionen bzw. 500-1500 Injektionen ausgetauscht werden26. Achten Sie darauf, vor und nach dem Ausführen einer Probencharge Leerzeichen zu injizieren. Wenn es eine große Anzahl von Proben innerhalb einer bestimmten Charge gibt, kann man auch in Betracht ziehen, eine Leerprobe in verschiedenen Intervallen innerhalb der Charge laufen zu lassen.
Das Protokoll bietet einen PASEF-basierten DDA-Workflow zum Nachweis von Histon-PTMs und zur Unterscheidung von isobaren und isomeren Spezies auf der Grundlage der Ionenmobilität.
Dieses Protokoll erfordert eine umfangreiche Probenvorbereitung, und die gesamte experimentelle Probenvorbereitungszeit sollte berücksichtigt werden. Im Durchschnitt dauert das Probenvorbereitungsprotokoll 2-3 Werktage. Darüber hinaus können Unterschiede zwischen Labor- und Geräteversionen die Gesamtempfindlichkeit der Analyse beeinträchtigen.
Nur sehr wenige proteomische Datenanalysesoftware wurde für den Einsatz bei der Analyse von Histonen über Bottom-up-Methoden ohne manuelle Anpassung oder Korrektur als angemessen erachtet 27,28,29. Die Ergebnisse sollten (zumindest zunächst) durch manuelle Analyse bestätigt werden, was ebenfalls zeitaufwändig ist. Wenn Analysesoftware verwendet wird, sollte sie über MS/MS-Annotationsfunktionen verfügen, die im Allgemeinen leicht zu bestätigen oder abzulehnen sind.
Es ist auch erwähnenswert, dass es unmöglich ist, Isomere durch Massenspektrometrie zu trennen, es sei denn, es wird eine TIMS-Zelle eingesetzt und Mobilitätswerte verwendet. So können beispielsweise die Positionen von Histonmodifikationen mit Hilfe von Fragmentierungsmustern (PASEF) bestimmt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Melvin A. Park und Matthew Willetts sind Mitarbeiter von Bruker Daltonics Inc., dem Hersteller des timsTOF-Instruments.
Acknowledgments
Dieses Material basiert auf Arbeiten, die von der National Science Foundation unter der Fördernummer unterstützt werden. HRD-1547798 und Grant No. HRD-2111661. Diese NSF-Zuschüsse wurden der Florida International University im Rahmen des CREST-Programms (Centers of Research Excellence in Science and Technology) gewährt. Dies ist der Beitrag Nummer 1672 des Institute of Environment, einem herausragenden Programm an der Florida International University. Zusätzliche Unterstützung wurde vom National Institute of Health im Rahmen des Grant No. R21AI135469 an Francisco Fernandez-Lima und Grant No. R01HD106051 an Benjamin A. Garcia sowie von der National Science Foundation unter Grant No. CHE-2127882 an Benjamin A. Garcia. Die Autoren danken Dr. Mario Gomez Hernandez für die anfängliche Unterstützung bei der ersten Methodenentwicklung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -80 °C Freezer | |||
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin-Free |
| 1 mL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL |
| 10 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked |
| 10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution |
| 10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 200 µL Gel-Loading Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL |
| 200 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 352070 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 96-well flat bottom plate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| 96-well plate, V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Acetonitrile (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher Chemical |
| Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF hydrochloride, 98% |
| Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥99.5% (T) |
| Ammonium hydroxide solution, NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS |
| Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH C18 HPLC column | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Heat shock fraction, pH 7, ≥98% |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anhydrous, powder, ≥97% |
| Cell dissociation buffer | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
| Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| Disposable Cell Lifters | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers |
| Disposable Pellet Pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| Formic acid (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagent, ≥96% |
| Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD | (Molex (Polymicro) | TSP075375 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
| Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
| High-Performance Liquid Chromatograph | Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System | |
| Hydrochloric acid, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS reagent, 37% |
| Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Hypersep cartridge | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥98% |
| Methanol, for HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima for HPLC, Fisher Chemical |
| Microcentrifuge Tube Adapters | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
| MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | LEAP PAL Parts | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | model: ND3300 | |
| Nitrogen (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| pH indicator strips, Instachek | Micro Essential Lab | JR-113 | Model: Hydrion |
| Potassium chloride, KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagent, 99.0%–100.5% |
| Pressure Injection Cell | Next Advance | model: PC77 | |
| Propionic Anhydride | Sigma Aldrich | 8.00608 | For synthesis |
| Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) | NuAire, model: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells |
| Sodium butyrate | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| SPE disk, C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm |
| SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor | Savant | model: SC210A | |
| Sucrose | Millipore | 1.07651 | suitable for microbiology |
| Sulfuric acid, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
| Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Suitable for HPLC, ≥99.0% |
| Triversa Nanomate | Advion | model: TR263 | |
| TrypsinProtease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Tube rotator | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
References
- Zhao, Z., Shilatifard, A.
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
- Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
- Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
- Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
- Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T.
- Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
- Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
- Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
- Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
- Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
- Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
- Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
- Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
- Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
- Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
- Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
- Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
- Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
- Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
- Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
- Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
- Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
- Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
- Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).
