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Chemistry

तरल क्रोमैटोग्राफी, ट्रैप्ड आयन मोबिलिटी स्पेक्ट्रोमेट्री, और टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके हिस्टोन संशोधन स्क्रीनिंग

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65589
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

Summary

तरल क्रोमैटोग्राफी, फंसे आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री, और समय-की-उड़ान द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-टीआईएमएस-टीओएफ एमएस / एमएस) के आधार पर उच्च आत्मविश्वास और हिस्टोन संशोधनों और पहचान के अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य "नीचे-ऊपर" विश्लेषण के लिए प्रमुख मापदंडों (प्रतिधारण समय [आरटी], टक्कर क्रॉस सेक्शन [सीसीएस], और सटीक द्रव्यमान-से-चार्ज [एम/जेड] अनुपात) के आधार पर एक विश्लेषणात्मक वर्कफ़्लो।

Abstract

हिस्टोन प्रोटीन यूकेरियोट्स के बीच अत्यधिक प्रचुर मात्रा में और संरक्षित होते हैं और पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) के रूप में जानी जाने वाली संरचनाओं के परिणामस्वरूप जीन विनियमन में एक बड़ी भूमिका निभाते हैं। बाहरी या आनुवंशिक कारकों के संदर्भ में प्रत्येक पीटीएम या पीटीएम के पैटर्न की स्थिति और प्रकृति की पहचान करने से यह जानकारी डीएनए प्रतिलेखन, प्रतिकृति या मरम्मत जैसे जैविक प्रतिक्रियाओं के साथ सांख्यिकीय रूप से सहसंबद्ध हो सकती है। वर्तमान कार्य में, जैविक नमूनों से हिस्टोन पीटीएम का पता लगाने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। पूरक तरल क्रोमैटोग्राफी, फंसे आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री, और टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-टीआईएमएस-टीओएफ एमएस / एमएस) का उपयोग एकल विश्लेषण में सबसे जैविक रूप से प्रासंगिक संशोधनों के पृथक्करण और पीटीएम असाइनमेंट को सक्षम बनाता है। वर्णित दृष्टिकोण गतिशीलता जाल में समानांतर संचय का उपयोग करके निर्भर डेटा अधिग्रहण (डीडीए) में हाल के विकास का लाभ उठाता है, इसके बाद अनुक्रमिक विखंडन और टक्कर-प्रेरित पृथक्करण होता है। हिस्टोन पीटीएम को आत्मविश्वास से उनके प्रतिधारण समय, गतिशीलता और विखंडन पैटर्न के आधार पर सौंपा गया है।

Introduction

यूकेरियोटिक कोशिकाओं में, डीएनए को क्रोमैटिन के रूप में कार्यात्मक इकाइयों में पैक किया जाता है जिन्हें न्यूक्लियोसोम कहा जाता है। ये इकाइयाँ चार कोर हिस्टोन (H2A, H2B, H3 और H4 में से प्रत्येक में दो)1,2,3,4के एक ऑक्टेमर से बनी होती हैं। हिस्टोन यूकेरियोट्स में सबसे प्रचुर मात्रा में और अत्यधिक संरक्षित प्रोटीनों में से हैं, जो जीन विनियमन5 के लिए काफी हद तक जिम्मेदार हैं। हिस्टोन पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) क्रोमैटिन गतिशीलता के नियमन में एक बड़ी भूमिका निभाते हैं और डीएनए प्रतिलेखन, प्रतिकृति और मरम्मत जैसे विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को कठोर करतेहैं। पीटीएम मुख्य रूप से हिस्टोन के एन-टर्मिनल क्षेत्रों की सुलभ सतह पर होते हैं जो डीएनए 3,7 के संपर्क में होते हैं। हालांकि, पूंछ और कोर संशोधनों क्रोमैटिन संरचना को प्रभावित, अंतर-न्यूक्लियोसोम बातचीत को बदलने और विशिष्ट प्रोटीन 3,8 की भर्ती.

तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) आधारित प्रोटिओमिक्स के दौरान एक वर्तमान चुनौती ब्याज के विश्लेषणों का संभावित सह-क्षालन है। डेटा-निर्भर विश्लेषण (डीडीए) के मामले में, यह एमएस/एमएस अधिग्रहण प्रक्रिया9के दौरान कई अग्रदूत आयनों के संभावित नुकसान में अनुवाद करता है। उड़ान का समय (टीओएफ) उपकरण बहुत उच्च आवृत्ति 9,10 (दसियों किलोहर्ट्ज़ तक)11पर स्पेक्ट्रा प्राप्त करते हैं; यह उन्हें एक जटिल नमूने (एमएस 1) के भीतर कुल अग्रदूत आयनों को तेजी से स्कैन करने में सक्षम बनाता है, इस प्रकार इष्टतम संवेदनशीलता और एमएस / एमएस अनुक्रमण दर (100 हर्ट्ज तक)9 का वादा करता है और उन्हें जैविक नमूना विश्लेषण10 के लिए आदर्श बनाता है। फिर भी, इन उच्च स्कैन दरों पर उपलब्ध संवेदनशीलता एमएस / एमएस दर9 द्वारा सीमित है। इन सीमाओं को कम करने के लिए ऑर्थोगोनल क्वाड्रूपोल टाइम-ऑफ-फ्लाइट (qToF) मास स्पेक्ट्रोमीटर के संयोजन में फंसे आयन गतिशीलता स्पेक्ट्रोमेट्री (TIMS) के अलावा इस्तेमाल किया गया था। TIMS में, सभी अग्रदूत आयनों अग्रानुक्रम में जमा कर रहे हैं और एक चौगुनी9 के साथ एकल अग्रदूत जनता का चयन करने के बजाय, उनकी गतिशीलता का एक समारोह के रूप में eluted. समानांतर संचय-सीरियल विखंडन (पीएएसईएफ) संवेदनशीलता के किसी भी नुकसान के बिना प्रति सेकंड सैकड़ों एमएस / एमएस घटनाओं की अनुमति देताहै 9.

इस कार्य का मुख्य उद्देश्य गतिशीलता जाल में समानांतर संचय का उपयोग करके डीडीए के हाल के विकास को दिखाना था, जिसके बाद अनुक्रमिक विखंडन और टक्कर-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) था। हिस्टोन पीटीएम को आत्मविश्वास से उनके प्रतिधारण समय (आरटी), गतिशीलता और विखंडन पैटर्न के आधार पर सौंपा गया था।

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Protocol

नोट: हिस्टोन के नमूने भानु एट अल (2020)12से अनुकूलित विधि का उपयोग करके निकाले गए थे।

1. नमूना तैयार करना

  1. संवर्धित कोशिकाओं की कटाई
    1. जब कोशिकाएं 80% संगम होती हैं, तो सुनिश्चित करें कि वे ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण का उपयोग करके व्यवहार्य हैं।
      नोट: इन प्रयोगों के लिए एक हेला एस 3 सेल लाइन का उपयोग किया गया था, लेकिन इस विधि को किसी भी सुसंस्कृत कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है।
    2. मीडिया को महाप्राण करें, फिर प्रत्येक प्लेट पर 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 5 एमएल लागू करें।
    3. सभी अवशिष्ट मीडिया को कुल्ला करने के लिए प्लेट (ओं) को घुमाएं, फिर पीबीएस को महाप्राण करें और 1x पीबीएस के 5 एमएल लागू करें।
    4. धीरे उन्हें एक डिस्पोजेबल सेल चोर के साथ scraping द्वारा थाली से कोशिकाओं को अलग.
    5. प्रत्येक सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मारो।
    7. सेल गोली से पीबीएस महाप्राण.
    8. हिस्टोन निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: फ्लैश फ्रीज तरल नाइट्रोजन में सेल गोली अगर यह तुरंत संसाधित नहीं किया जा सकता है. आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों को स्टोर करें।
  2. हिस्टोन निष्कर्षण
    1. प्रत्येक सेल गोली की मात्रा का अनुमान लगाएं और एक स्थायी मार्कर के साथ meniscus निशान.
    2. सभी नमूनों के लिए पर्याप्त परमाणु अलगाव बफर (एनआईबी; 15 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.5), 15 एमएम एनएसीएल, 60 एमएम केसीएल, 5 एमएम एमजीसीएल2, 1 एमएम सीएसीएल2, और 250 एमएम सुक्रोज) तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, यदि कई नमूनों को समय के साथ संसाधित करने की आवश्यकता होती है, तो बफर को थोक में बनाएं और 6 महीने तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, या विभाज्य और -15 डिग्री सेल्सियस से -25 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल तक फ्रीज करें केवल प्रत्येक निष्कर्षण के लिए आवश्यक राशि।
      नोट: भंडारण के दौरान बफर स्पष्ट रहना चाहिए। यदि बफर किसी भी समय बादल या अन्यथा असामान्य उपस्थिति पर ले जाता है, तो त्यागें और ताजा बफर तैयार करें।
    3. वॉश बफर के सेल छर्रों की मात्रा 50 गुना तैयार करें और निम्नानुसार अवरोधक जोड़ें (2 नमूनों में वॉश बफर के लगभग 10 एमएल)।
      1. वॉश बफर के 10 एमएल तैयार करने के लिए, एनआईबी के 10 एमएल, 200 एमएम 4- (2-एमिनोइथिल) बेंजीनसल्फोनील फ्लोराइड हाइड्रोक्लोराइड [एईबीएसएफ] के 30 माइक्रोन, 1 एम डाइथियोथ्रेइटोल [डीटीटी] के 10 माइक्रोन, 5 माइक्रोन माइक्रोकिस्टिन के 20 माइक्रोन, 5 एम सोडियम ब्यूटिरेट के 20 माइक्रोन मिलाएं।
    4. लाइसिस बफर तैयार करने के लिए वॉश बफर का 1/5 निकालें (वॉश बफर से 1/5 वॉल्यूम, 0.3% एनपी-40 या एनपी-40 विकल्प)।
      नोट: एनपी -40 या एनपी -40 विकल्प के बजाय ट्राइटन-एक्स 100 का उपयोग न करें, क्योंकि यह कुछ सेल प्रकारों के लिए बहुत अपघर्षक हो सकता है।
    5. सेल गोली को वॉश बफर के 5 कॉलम में निलंबित करके अच्छी तरह से धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग करें। इस चरण को दो बार पूरा करें, धोने के बीच सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट और त्याग दें।
    6. सुनिश्चित करें कि सेल गोली की मात्रा अभी भी एक स्थायी मार्कर के साथ चिह्नित है. लाइसिस बफर के 10 संस्करणों में पुन: निलंबित करें।
    7. विंदुक मिश्रण प्रत्येक गोली अच्छी तरह से निलंबित करने के लिए, तो बर्फ पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
    8. 15 मिनट के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    9. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और त्यागें।
      नोट: गोली को मूल गोली आकार ≤ 1/2 तक कम करना चाहिए (जैसा कि मार्कर लाइन द्वारा दर्शाया गया है)। यदि गोली पर्याप्त रूप से कम नहीं हुई है, तो लसीका प्रक्रिया को दोहराएं और कोशिकाओं को खोलने के लिए मूसल का उपयोग करके एक कोमल समरूपता कदम शामिल करें।
    10. एक बार lysis पूरा हो गया है, धोने बफर के 500 माइक्रोन में गोली resuspend, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और त्यागें, फिर एनपी -40 के सभी निशान हटाने के लिए एक बार फिर धोने के कदम को दोहराएं।
      नोट: इस बिंदु पर, गोली क्रोमैटिन के होते हैं, जिसमें हिस्टोन होते हैं।
    11. 0.4 एन एच2एसओ4 के 5 संस्करणों (मूल सेल गोली आकार के) में गोली को फिर से निलंबित करें।
    12. एक आंदोलनकारी का उपयोग कर एक ठंडे कमरे या रेफ्रिजरेटर में 2 घंटे के लिए सेते हैं.
    13. 2 घंटे के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 3400 x ग्राम पर नमूना (ओं) को अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला को न छोड़ें।
    14. सतह पर तैरनेवाला को नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और 100% ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (टीसीए) को सामग्री की मात्रा 1/3 तक बढ़ाएं (अंतिम टीसीए एकाग्रता लगभग 20% होगी)।
    15. धीरे ट्यूब उल्टा और निरीक्षण है कि स्पष्ट, रंगहीन समाधान सफेद और/या बादल बदल जाता है, प्रोटीन वर्षा का संकेत.
      नोट: कम हिस्टोन सांद्रता वाले समाधान के लिए, प्रोटीन वर्षा तुरंत ध्यान देने योग्य नहीं हो सकती है, लेकिन रात भर इनक्यूबेशन के बाद अवक्षेप दिखाई देना चाहिए।
    16. हिस्टोन प्रोटीन को पूरी तरह से अवक्षेपित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (12-18 एच) गड़बड़ी के बिना सेते हैं।
    17. अगले दिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 3400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    18. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, विंदुक टिप के साथ ट्यूब के किनारों को छूने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है. इस स्तर पर, हिस्टोन मुख्य रूप से ट्यूब (ओं) के किनारों के आसपास एक फिल्म के रूप में जमा होते हैं।
    19. एक ग्लास पाश्चर विंदुक का उपयोग करके, प्रत्येक ट्यूब में बर्फ-ठंडा एसीटोन + 0.1% एचसीएल (एसिड एसीटोन) के 500 माइक्रोन जोड़ें, फिर धीरे से ट्यूब (ओं) को कई बार उलट दें। ऐसा करते समय नमूनों को क्रम (1, 2, 3, आदि) में व्यवस्थित करें, क्योंकि कोई भी गलत एसीटोन ट्यूबों पर चिह्नों को हटा सकता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 3400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और धीरे-धीरे सतह पर तैरनेवाला छानना।
    20. बर्फ ठंड 100% एसीटोन के 500 माइक्रोन के साथ इस rinsing कदम को दोहराएँ, वह भी एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 3400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और धीरे-धीरे सतह पर तैरनेवाला छानना।
    21. ट्यूबों को कमरे के तापमान पर सूखने के लिए खुला छोड़ दें जब तक कि शेष एसीटोन वाष्पित न हो जाए।
    22. सूखने पर, प्रत्येक ट्यूब में मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) -ग्रेड पानी के 100 माइक्रोन जोड़ें। पूरे हिस्टोन फिल्म को फिर से निलंबित करने के लिए कंटेनर के सभी किनारों को स्वाब करने के लिए इस छोटी बूंद का उपयोग करें। ट्यूब के किनारे पर छोटी बूंद को पाइप करके और ऊपर और नीचे पाइपिंग करते समय इसे घुमाकर या 100 माइक्रोन के आधे हिस्से को वितरित करके और टिप का उपयोग करके इसे चारों ओर हिलाने के लिए करें। दोनों विधियों का संयोजन सबसे अच्छा काम करता है। हिस्टोन पानी में आसानी से घुलनशील हैं और समाधान में होंगे।
    23. सभी नमूनों को निलंबित करने के बाद, यदि कोई शेष सफेद ठोस है, तो 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्नान में सोनिकेट करें।
    24. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। ताजा ट्यूबों के लिए स्पष्ट समाधान स्थानांतरण. किसी भी शेष अघुलनशील गोली त्यागें.
    25. निष्कर्षण साफ है कि सत्यापित करने के लिए शर्तों को कम करने के तहत एक एसडीएस-पेज चलाएँ।
      नोट: जैल को पॉलीक्रिलामाइड की किसी भी उपयुक्त एकाग्रता का उपयोग करके चलाया जा सकता है जब तक कि यह 10-20 केडीए की सीमा में प्रोटीन को अलग कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल जैल के लिए सामग्री की तालिकादेखें.
    26. कुल प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक प्रोटीन एकाग्रता परख (यानी, ब्रैडफोर्ड या बीसीए) करें।
  3. लाइसिन अवशेषों का रासायनिक व्युत्पन्न (प्रोपियोनाइलेशन)
    1. एक साफ ट्यूब में हिस्टोन (प्रोटीन परख द्वारा निर्धारित) के 20 माइक्रोग्राम स्थानांतरण। वैक्यूम सांद्रक का उपयोग करके इस नमूने को <5 माइक्रोन तक सुखाएं, फिर 100 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट (एनएच4सीओ3) (~ 1 माइक्रोग्राम/माइक्रोन समाधान) के 20 माइक्रोन का उपयोग करके फिर से निलंबित करें। यदि आवश्यक हो तो अमोनियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग करके पीएच को ~ 8 में समायोजित करें।
      चेतावनी: अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (एनएच4ओएच) को निलंबित करने के लिए उपयोग न करें, यदि आवश्यक हो तो केवल पीएच को समायोजित करने के लिए। अन्यथा, प्रोटीन विकृत हो जाएगा और अवक्षेपित हो जाएगा।
      नोट: न्यूनतम नमूना हानि के साथ पीएच की जांच करने के लिए, नमूने में डुबकी लगाने के लिए एक विंदुक टिप का उपयोग करें और पीएच पट्टी पर थपका दें। यह परीक्षण प्रक्रिया शेष नमूना तैयार करने के चरणों में उपयोगी होगी।
    2. प्रोपियोनिलेशन अभिकर्मक को 1: 3 (वी / वी) अनुपात में एसीटोनिट्राइल (एसीएन) में प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड जोड़कर प्रोपियोनिलेशन अभिकर्मक तैयार करें (यानी, अभिकर्मक के 40 माइक्रोन बनाने के लिए, एसीएन के 30 माइक्रोन के साथ प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड के 10 माइक्रोन को मिलाएं)।
      नोट: परंपरागत रूप से, मेथनॉल या आइसोप्रोपेनॉल का उपयोग प्रोपियोनिलेशन अभिकर्मक की तैयारी में किया गया है। चूंकि प्रोपियोनिलेशन एक एमाइड गठन प्रतिक्रिया है, एसीटोनिट्राइल की तरह एक गैर-प्रोटोनिक विलायक, अवांछित साइड उत्पादों और प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए आवश्यक है, जैसे मिथाइल प्रोपियोनिल एस्टर, जो मेथनॉल का उपयोग करने के परिणामस्वरूप होता है। केवल एक समय में 4 नमूनों के लिए पर्याप्त प्रोपियोनिलेशन अभिकर्मक तैयार करें ताकि अभिकर्मक ताजा रहे। तैयारी के 1-2 मिनट के भीतर अभिकर्मक का प्रयोग करें. जैसे ही अभिकर्मक बैठता है, प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड किसी भी परिवेश की नमी के साथ प्रतिक्रिया करेगा, और एसिटिक एसिड बनना शुरू हो जाएगा, जो अभिकर्मक की प्रभावशीलता को बदल सकता है और अभिकर्मक जोड़े जाने के बाद हिस्टोन समाधान के पीएच को बदल देगा।
    3. 1: 4 (वी / वी) में प्रत्येक नमूने में प्रोपियोनिलेशन अभिकर्मक जोड़ें (यानी, हिस्टोन के 20 माइक्रोन के लिए, प्रोपियोनिलेशन अभिकर्मक के 5 माइक्रोन जोड़ें)।
    4. ~ 8 के समाधान के पीएच को फिर से स्थापित करने के लिए जल्दी से 1: 5 (वी / वी) एनएच4ओएच (यानी, हिस्टोन समाधान के 20 माइक्रोन के लिए 4 माइक्रोन जोड़ें) जोड़ें। यदि पीएच अभी भी बहुत कम है, तो एक बार में एनएच4ओएच के 1-2 माइक्रोन जोड़ें जब तक कि 8 का पीएच हासिल न हो जाए। आमतौर पर, 1:5 (v/v) अनुपात पर्याप्त होता है।
    5. बिना किसी गड़बड़ी के 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने इनक्यूबेट करें।
    6. कम से कम एसिड गठन सुनिश्चित करने के लिए प्रोपियोनिलेशन अभिकर्मक के प्रति बैच 3-4 से अधिक नमूनों के लिए प्रोपियोनिलेशन प्रतिक्रिया दोहराएं।
    7. प्रोपियोनिलेशन प्रक्रिया चरणों 1.3.2-1.3.5 को दोहराएं। प्रोपियोनिलेशन का दूसरा दौर यह सुनिश्चित करता है कि उपलब्ध लाइसिन का >95% व्युत्पन्न है।
    8. एक वैक्यूम सांद्रक का उपयोग करके नमूनों को <5 माइक्रोन तक सूखें। यह एनएच4ओएच से जारी किसी भी अनियंत्रित प्रोपियोनाइलेशन अभिकर्मक, एसिड उत्पादों और अमोनिया गैस को वाष्पित कर देगा। यदि नमूने पूरी तरह से सूख जाते हैं, तो यह ठीक है, क्योंकि कोई महत्वपूर्ण नमूना नुकसान नहीं होता है।
      नोट: बोतल में शेष परिवेश नमी के संपर्क के कारण एसिटिक एसिड के गठन को रोकने के लिए भंडारण से पहले आर्गन गैस के साथ प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड बोतल में हवा को विस्थापित करें।
  4. ट्रिप्सिन के साथ प्रोटियोलिटिक पाचन
    1. 100 एमएम एनएच4एचसीओ3 में हिस्टोन को 20 माइक्रोन की मात्रा प्राप्त करने के लिए, 1 माइक्रोग्राम/जेडएल की इष्टतम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए फिर से निलंबित करें।
      नोट: 1 μg/μL से कम सांद्रता वाले नमूना समाधानों के परिणामस्वरूप ट्रिप्सिन दक्षता में कमी आएगी।
    2. 1:10 अनुपात (wt/wt) पर हिस्टोन नमूनों में ट्रिप्सिन जोड़ें (यानी, ट्रिप्सिन के 1 μg/μL समाधान के 2 μL को 20 μg हिस्टोन में जोड़ें)।
    3. 6-8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं. वैकल्पिक रूप से, कमरे के तापमान पर रात भर (12-18 घंटे) सेते हैं.
    4. कम से कम 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ठंड से पाचन बंद करो।
      नोट: पाचन प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए एसिड का उपयोग न करें, क्योंकि इससे प्रक्रिया में इस बिंदु पर पीएच में अवांछित गिरावट आएगी। नमूना -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक आगे बढ़ने के लिए तैयार (अंतरिम रोक बिंदु).
  5. पेप्टाइड एन-टर्मिनलों का रासायनिक व्युत्पन्न (प्रोपियोनिलेशन)
    1. एक वैक्यूम सांद्रक का उपयोग करके नमूनों को <5 माइक्रोन तक सुखाएं।
    2. 100 एमएम एनएच4एचसीओ3 का उपयोग करके 20 माइक्रोन (1 माइक्रोग्राम/जेडएल) तक के नमूनों को फिर से निलंबित करें।
    3. पहले की तरह प्रोपियोनाइलेशन दोहराएं (चरण 1.3)।
      नोट: यह सामान्य है कि नमूने उच्च जलीय के कारण इस चरण में सूखने में अधिक समय लेते हैं: कार्बनिक चरण अनुपात।
  6. स्टेज-टिप्स के साथ नमूना डिसाल्टिंग
    1. एमएस-ग्रेड पानी + 0.1% टीएफए के 50 माइक्रोन के साथ नमूनों को फिर से निलंबित या पतला करें।
    2. एक 11 जी नमूना कोरर का प्रयोग, एक ठोस चरण निष्कर्षण डिस्क से सी18 सामग्री के 5 डिस्क पंच (विंदुक टिप करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले सभी 5 डिस्क पंच). सम्मिलित करें और सुनिश्चित करें कि डिस्क सुरक्षित रूप से और समान रूप से 200 माइक्रोन विंदुक टिप(चित्रा 1)के तल पर लगाए गए हैं।
      नोट: 15-जी कोरर का उपयोग करें यदि एक चरण-टिप के माध्यम से नमूना के 25 माइक्रोग्राम से अधिक डिसाल्टिंग करें।
    3. 1.5 एमएल या 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्टेज-टिप्स को पकड़ने के लिए एक अपकेंद्रित्र एडाप्टर का उपयोग करें।
      नोट: निम्नलिखित सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों के लिए, एक समय में 1-2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धीमी (400-500 x ग्राम) क्रांति का उपयोग करें; सॉल्वैंट्स सामान्य रूप से 1 मिनट से भी कम समय में राल से गुजरते हैं, यह इस बात पर निर्भर करता है कि सी18 सामग्री को युक्तियों में कितनी कसकर पैक किया जाता है।
    4. सी18 सामग्री को सक्रिय करने और संभावित दूषित पदार्थों को हटाने के लिए 100% एसीटोनिट्राइल के 50 माइक्रोन के साथ सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा राल को कुल्ला।
      नोट: जेल-लोडिंग विंदुक युक्तियों का उपयोग करके चरण-युक्तियों पर समाधान लोड करना आसान हो सकता है। एक बार सी18 सामग्री सक्रिय हो जाने के बाद, यह महत्वपूर्ण है कि राल को डिसाल्टिंग प्रक्रिया की अवधि के लिए सूखने न दें।
    5. सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एमएस-ग्रेड पानी + 0.1% टीएफए के 80 माइक्रोन के साथ डिस्क सामग्री को संतुलित करें।
    6. ग्लेशियल एसिटिक एसिड का उपयोग करके नमूने को पीएच 4 या उससे कम करने के लिए अम्लीकृत करें। नमूना हानि को कम करने के लिए पहले के रूप में पीएच स्ट्रिप्स के साथ पीएच की जाँच करें।
    7. धीमी गति से सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा राल डिस्क पर नमूना की संपूर्णता लोड करें।
    8. सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एमएस-ग्रेड पानी + 0.1% टीएफए के 80 माइक्रोन के साथ नमूना धोएं।
    9. धीमी गति से सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 75% एसीटोनिट्राइल के 70 माइक्रोन और 0.5% एसिटिक एसिड को फ्लश करके एक साफ 1.5 एमएल ट्यूब में नमूना एल्यूट करें। अतिरिक्त centrifugation समय का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है कि पूर्ण नमूना मात्रा चरण-टिप से eluted है। यह ठीक है अगर राल अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन समय के साथ सूख जाता है, क्योंकि नमूने के क्षालन से पहले इसकी आवश्यकता नहीं होती है।
    10. प्रत्येक नमूने को पूरी तरह से वैक्यूम सांद्रक में सुखाएं।
      नोट: नमूना (ओं) -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक आगे बढ़ने के लिए तैयार (अंतरिम रोक बिंदु)।
    11. एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए, तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) प्रोटोकॉल से सॉल्वेंट ए (0.1% फॉर्मिक एसिड) की मात्रा में नमूनों का पुनर्गठन करें जो 0.4 माइक्रोग्राम / μL की अंतिम एकाग्रता देता है (यानी, विलायक ए के 50 माइक्रोन में हिस्टोन के 20 माइक्रोग्राम को भंग करें)।

2. टीआईएमएस सॉफ्टवेयर इंटरफेस

  1. साधन टैब का चयन करें और संचालित करने के लिए स्विच (सत्यापित करें कि साधन का नाम हरे रंग में हाइलाइट हो जाता है) (चित्रा 2).
  2. TIMS मापदंडों (चित्रा 2) की जाँच करें.
  3. एमएस सेटिंग्स सत्यापित करें (स्कैन शुरू, स्कैन अंत, आयन ध्रुवीयता, स्कैन मोड) (चित्रा 2)।
  4. TIMS सेटिंग्स (मोड, गतिशीलता शुरू, गतिशीलता अंत, रैंप समय, संचय समय, कर्तव्य चक्र, रैंप दर, एमएस दर, एमएस औसत, और autocalibration) (चित्रा 2) सत्यापित करें.
  5. स्रोत टैब पर जाएं और केवल ट्यूनमिक्स अंशांकन चरण(चित्रा 3)13के लिए सिरिंज विकल्प (हैमिल्टन 500 माइक्रोन) को सक्रिय करें।
  6. कैलिब्रेशन टैब पर जाएं, m/z पर क्लिक करें, कैलिब्रेशन मोड चुनें, और मोड चुनें (एन्हांस्ड Q, आम तौर पर), ज़ूम (+0.01%) STD Dev (0.24), और कैलिब्रेट पर क्लिक करें; जब 100% का स्कोर हासिल किया जाता है, तो स्वीकार करें (चित्रा 4)।
  7. मोबिलिटी टॅबवर जा आणि कॅलिब्रेशन प्रक्रिया (रैखिक मोड, सामान्यतः), डिटेक्शन रेंज (+5%), रुंदी (0.1 Da), STD Dev (0.1855) दुबारा, नंतर कॅलिब्रेट करा क्लिक करा; जब आप 98.5% ≥ स्कोर प्राप्त करते हैं, तो स्वीकार करें (चित्रा 5)।
  8. विधि पर जाएं और उपयोग की जाने वाली विधि का चयन करें; यस उदाहरणको लागि, Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl चयन गरिएको थियो(चित्र 5)।

3. एलसी-टिम्स-पीएएसईएफ-टीओएफ एमएस / एमएस

  1. विशिष्ट एनईएसआई ऑपरेटिंग स्थितियों का उपयोग करें: 4500 वी केशिका वोल्टेज, 800 वी एंडप्लेट ऑफसेट, 3.0 बार नेब्युलाइज़र दबाव, 10.0 एल / मिनट सूखी गैस, 200 डिग्री सेल्सियस सूखी हीटर, और 50 माइक्रोन / मिनट इंजेक्शन प्रवाह दर।
  2. विशिष्ट एमएस सेटिंग्स का उपयोग करें: 6 ईवी टकराव ऊर्जा, 1200 वीपीपी टक्कर आरएफ, 75 μs स्थानांतरण समय, 5 μs प्रीपल्स स्टोरेज।
  3. प्रवेश फ़नल P1 और निकास फ़नल P2 से दबाव अंतर का उपयोग करके बहाव गैस प्रवाह का निर्धारण करें। समानांतर संचय-धारावाहिक विखंडन (PASEF) TIMS सेल में होता है, जो व्यक्तिगत रूप से बजाय एक साथ सभी अग्रदूत आयनों को जमा करता है। अग्रदूत आयनों तो संकीर्ण आयन चोटियों बनाम सामान्य रूप से बहुत व्यापक चोटियों (के बारे में 50 बार कम) में जारी कर रहे हैं, अभी भी गतिशीलता14 के माध्यम से सह eluting पेप्टाइड्स अलग करते हुए संकेत से शोर अनुपात में वृद्धि.
  4. प्रोटियोलिटिक हिस्टोन पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए एक LC-TIMS-ToF MS/MS विधि विकसित करें। मालिकाना PASEF तकनीक के साथ एक वाणिज्यिक TIMS-TOF MS उपकरण के साथ C18 (300 Å, 5 μm, 4.6 मिमी x 250 मिमी) कॉलम के साथ लगाए गए एक उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफ (HPLC) को युगल करें।
    नोट: यह स्तंभ आकार पेप्टाइड मिश्रण के लिए उच्च और निम्न पीएच दोनों पर अच्छा पृथक्करण प्रदान करने के लिए निर्धारित किया गया था, जो पहले प्रकाशित कार्यों 15,16,17पर आधारित था।
    1. इंजेक्शन मात्रा को नमूना के 20 माइक्रोन (8 माइक्रोग्राम) और 0.4 एमएल/मिनट प्रवाह दर पर सेट करें।
    2. 0.1% फॉर्मिक एसिड (सॉल्वेंट ए) और 0.1% फॉर्मिक एसिड (सॉल्वेंट बी) के साथ एसीटोनिट्राइल के साथ पानी का उपयोग करके 60 मिनट, गैर-रैखिक एलसी ढाल चलाएं। ढाल सेट करें: 2.7 मिनट के लिए 10% बी, फिर 5.3 मिनट में 20% बी, 4 मिनट में 28% बी, एक और 18 मिनट में 35% बी, 13 मिनट में 40% बी, और एक और 2 मिनट में 100% बी। 5 मिनट के लिए 100% बी धारण करने के बाद, 5 मिनट में 10% बी के लिए एकाग्रता कम और अंतिम 5 मिनट के लिए पकड़.
  5. सकारात्मक आयनीकरण मोड में नैनो-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (एनईएसआई) के माध्यम से टीआईएमएस-टीओएफ में एचपीएलसी से नमूना क्षालन सत्यापित करें।

4. डेटा विश्लेषण

  1. पेप्टाइड अनुक्रमों और संशोधन साइटों की पहचान करें।
    1. एमएस-डाइजेस्ट टूल के तहत प्रोटीनप्रॉस्पेक्टर [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] का उपयोग करके पेप्टाइड्स की एक सैद्धांतिक सूची तैयार करें।
      1. डाइजेस्ट (एंजाइम का इस्तेमाल किया) की स्थितियों को ध्यान में रखते हुए एक सैद्धांतिक पाचन करें, पीटीएम के प्रकारों की खोज की जा रही है (जैसे, मोनो-, डी- या ट्राइमेथिलेशन), पेप्टाइड्स की आकार सीमा की खोज की जा रही है, साथ ही साथ मास डिटेक्शन रेंज और मिस्ड क्लीवेज की संभावित संख्या।
  2. सैद्धांतिक पेप्टाइड्स(चित्रा 6)12के आधार पर अधिग्रहित डेटा का मैन्युअल रूप से विश्लेषण करें।
    1. प्रत्येक सैद्धांतिक पेप्टाइड के लिए कई चार्ज राज्यों (+1 से +4) पर जनता के लिए खोज की जाती है।
    2. प्रत्येक एम / जेड की प्रारंभिक पहचान के बाद, चोटी का चयन करें और पीटीएम सहित पेप्टाइड अनुक्रम के आधार पर विखंडन आयनों की एक सैद्धांतिक सूची का उपयोग कर एमएस / एमएस की पुष्टि करें।
      नोट: यदि पहचाने गए पेप्टाइड की गतिशीलता पहले ज्ञात थी, तो यह भी पुष्टि की जाती है।
  3. विभिन्न पीटीएम के सापेक्ष बहुतायत की गणना करें और निर्दिष्ट पेप्टाइड अनुक्रम के प्रतिशत के रूप में प्रत्येक संशोधन की रिपोर्ट करें।
    1. प्रत्येक पता लगाए गए पीटीएम की सापेक्ष बहुतायत की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके की जाती है:
      सापेक्ष बहुतायत = पीटीएम का क्षेत्रफल/किसी दिए गए पेप्टाइड के लिए असंशोधित और पीटीएम का कुल क्षेत्रफल

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Representative Results

एक नीचे-अप प्रोटिओमिक वर्कफ़्लो (चित्रा 7) में आम तौर पर निम्नलिखित शामिल होते हैं: एक कच्चे नमूने से लक्ष्य प्रोटीन (ओं) का निष्कर्षण, इसके बाद प्रोटीन (ओं) की एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करना, और फिर अंश, आमतौर पर जेल वैद्युतकणसंचलन या तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा। अंश के बाद, प्रोटीन एक प्रोटियोलिटिक एंजाइम (अक्सर ट्रिप्सिन) का उपयोग करके पचा रहे हैं, और अंत में, एक स्थापित डेटाबेस18 का उपयोग कर परिणामी पेप्टाइड्स और प्रोटीन पहचान के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण. अनुक्रम जानकारी संकेत दिए गए द्रव्यमान-से-चार्ज (एम/जेड) रेंज के भीतर अग्रदूत आयनों से ली गई है, जो टक्कर-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) के अधीन हैं, जो डेटाबेस19 (चित्रा 8)का उपयोग करके पहचाने जाने और अनुक्रमित किए जाने वाले विखंडन पैटर्न का उत्पादन करते हैं।

इस काम के लिए, मुख्य लक्ष्य प्रोटोकॉल अनुभाग में पहले वर्णित चरणों का पालन करते हुए LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA विधि विकसित करना और लागू करना था। आइसोमेरिक और आइसोबैरिक पेप्टाइड्स पर पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों की स्थिति का निर्धारण ने पहचान और स्पेक्ट्रम व्याख्या के संबंध में एक विशेष चुनौती प्रस्तुत की है। इस अध्ययन में, पुनः संयोजक मानव हिस्टोन मानकों और HeLa S3 कोशिकाओं को नमूने के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS के माध्यम से मानव हिस्टोन मानकों के हिस्टोन PTM विश्लेषण से प्रति पेप्टाइड 5 चार्ज के साथ मध्यम से बड़े आकार के पेप्टाइड्स (लंबाई में 3-30 अमीनो एसिड) प्राप्त हुए। प्रोपियोनिलेशन प्रक्रिया आमतौर पर ट्रिप्टिक पाचन द्वारा उत्पादित लोगों की तुलना में लंबे, अधिक जानकारीपूर्ण पेप्टाइड्स का उत्पादन करने में सफल रही। डेटा विश्लेषण पर, पेप्टाइड्स को विभिन्न संशोधित राज्यों में पहचाना गया था। एक लाभ के रूप में, TIMS- आधारित विधि ने एक ही PTM ले जाने वाले कुछ स्थितीय आइसोमेरिक पेप्टाइड्स को विभेदित किया। उदाहरण के लिए, दो आइसोमेरिक प्रजातियां प्रतिधारण समय और एम / हालांकि, दो संकेतों को गतिशीलता डोमेन (चित्रा 9) में अलग किया जा सकता है।

चित्रा 9 में दिखाए गए पेप्टाइड्स के लिए संबंधित विखंडन स्पेक्ट्रा को उपयुक्त फास्टा फाइलों का उपयोग करके प्रोटिओमिक विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा एनोटेट किया गया था। चित्रा 9 ए में, असंशोधित पेप्टाइड को तीन प्रोपियोनिल (+56.03) समूहों (एन-टर्मिनल, लाइसिन 18 और लाइसिन 23 पर) के साथ देखा जाता है। चित्रा 9 बी में, पेप्टाइड लाइसिन 18 पर एक एसिटाइल समूह (+42.02) और दो प्रोपियोनिल समूहों (एन-टर्मिनल पर एक और लाइसिन 23 पर एक) के साथ मनाया जाता है। अंत में, चित्रा 9 सी में पेप्टाइड को लाइसिन 23 और दो प्रोपियोनिल समूहों (एन-टर्मिनल और लाइसिन 18 पर) पर मनाया गया एसिटिलीकरण के साथ देखा जाता है। जैसा कि पहले प्रकाशित किया गया था, PASEF लाभ का उपयोग एक ही सुविधा को बार-बार लक्षित करके अनुक्रमण गति और संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए किया जा सकताहै 9. यह उपयोगकर्ता जैविक नमूनों से अधिक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है. इस मामले में, यह प्रत्येक हिस्टोन पर होने वाले पीटीएम के प्रकार और स्थिति पर लागू होता है।

पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन विश्लेषण को अनुक्रम कवरेज प्लॉट के रूप में नेत्रहीन रूप से भी दर्शाया जा सकता है, जैसा कि चित्र 10 में देखा गया है। चित्रा 10 ए में, हिस्टोन एच 3 मानक जिसे पाचन से पहले प्रोपियोनिलेट किया गया है, नीली रेखाओं द्वारा निरूपित अन्यथा होने वाले पेप्टाइड्स के साथ प्रस्तुत करता है। हेला एस 3 कोशिकाओं से निकाले गए हिस्टोन को उसी फैशन में संसाधित किया गया था, जैसा कि चित्रा 10 बी द्वारा दर्शाया गया है। कई पीटीएम का संकेत दिया गया था, जिसमें एक ही अमीनो एसिड पदों पर कई अलग-अलग पैटर्न शामिल थे। जैविक नमूनों से यह उम्मीद की जानी चाहिए। ध्यान दें, चित्रा 10 बी में कुछ ग्रे लाइनें पेप्टाइड्स को दर्शाती हैं जिन्हें कम तीव्रता के परिणामस्वरूप एमएस2 की कमी के कारण अस्पष्ट रूप से पहचाना गया था।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और चरण युक्तियों का उत्पादन। (एजी) सी 18-सिलिका डिस्क चरण टिप के निर्माण पर चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: डाटा प्रोसेसिंग: पेप्टाइड Mix_QC प्रोपियोनिलेटेड मानक हिस्टोन 20210804। डेटा को संसाधित करना शुरू करने से पहले, बेस पीक क्रोमैटोग्राम (बीपीसी + ऑल एमएस) से उन मानों को निकालने के लिए संभावित चार्ज राज्यों और उनके विखंडन (1550.9013; 775.9543; 517.6386; आदि) की सैद्धांतिक सूची तैयार करना सुनिश्चित करें। प्रत्येक पेप्टाइड निकालने के बाद, सुनिश्चित करें कि यह आंकड़ा में दिखाया विश्लेषण सूची की तरह लग रहा है. शिखर 775.9543 को एक उदाहरण के रूप में चुना गया। आकृति के दाईं ओर, तीन ग्राफ़ दिखाए गए हैं: पहला क्रोमैटोग्राम (तीव्रता बनाम समय ग्राफ) से मेल खाता है, दूसरा मोबिलोग्राम से मेल खाता है, और तीसरा PASEF विखंडन के साथ द्रव्यमान स्पेक्ट्रम से मेल खाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: timsControl प्रोटोकॉल चरण 1-4. आंकड़ा टिम्स कंट्रोल प्रक्रिया के पहले चार चरणों को दर्शाता है। ऊपरी बाईं ओर, उपकरण और सॉफ्टवेयर के बीच कनेक्शन को चालू और बंद करने के लिए इंस्ट्रूमेंट बटन पर क्लिक करें। किसी भी कार्य को निष्पादित करने से पहले, यह सुनिश्चित करना चाहिए कि सॉफ्टवेयर ऑपरेटिंग मोड में है। अंत में, सत्यापित करें कि TIMS पैरामीटर सही हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: स्रोत पैरामीटर। इस मामले में, सिरिंज हैमिल्टन 500 माइक्रोन का उपयोग केवल ट्यूनमिक्स के लिए किया गया था। सत्यापित करें कि अन्य पैरामीटर सही रहते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: द्रव्यमान-से-चार्ज (एम / नीचे बाएं पैनल अंशांकन मोड में 100% का स्कोर प्राप्त होने तक कैलिब्रेट का चयन करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: गतिशीलता अंशांकन। निचले बाएँ पैनल अंशांकन मोड में कम से कम 98.5% का स्कोर प्राप्त होने तक कैलिब्रेट का चयन करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: विशिष्ट नीचे-ऊपर प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो। नमूना तैयार करने से लेकर पहचान तक की प्रक्रियाओं का चरण-दर-चरण9. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: प्रतिधारण समय, आइसोटोपिक पैटर्न, और एच 3 18-26 गतिशीलता प्रोफाइल। (ए) असंशोधित प्रोपियोनाइलेटेड, (बी) के 23 एसी पेप्टाइड अन्य दो पदों में प्रोपियोनाइलेटेड, और (सी) के 18 एसी अन्य दो पदों में प्रोपियोनाइलेटेड। पैनल बी और सी में दिखाए गए संरचनात्मक आइसोमर्स के मामले के लिए गतिशीलता पृथक्करण के फायदों पर ध्यान दें, कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: पीएएसईएफ का उपयोग करके एमएस/एमएस विखंडन पेप्टाइड अनुक्रमण का उदाहरण। टुकड़ा स्पेक्ट्रा एमिनो एसिड पदों 18-26 के साथ एच 3 पेप्टाइड के लिए प्रोटिओमिक विश्लेषण सॉफ्टवेयर से प्राप्त किए गए थे. (ए) अनमॉडिफाइड प्रोपियोनाइलेटेड, (बी) के 23 एसी पेप्टाइड प्रोपियोनाइलेटेड अन्य दो पदों में, और (सी) के 18 एसी अन्य दो पदों में प्रोपियोनाइलेटेड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: एक दृश्य हिस्टोन पीटीएम विश्लेषण सारांश का उदाहरण। हेला एस 3 कोशिकाओं से (ए) एच 3 मानक और (बी) एच 3 से मनाया पेप्टाइड्स और पीटीएम के परिणाम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: मानक और HeLa S3 पेप्टाइड LC-TIMS-ToF MS/MS विशेषताओं। प्रयोगात्मक गुणों (यानी, प्रतिधारण समय, एम / जेड, 1 / केओ, और एलसी पीक क्षेत्रों) सहित लक्ष्य और मनाया पेप्टाइड सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हिस्टोन बुनियादी प्रोटीन होते हैं जो ऑक्टेमर के रूप में डीएनए के साथ बातचीत करके क्रोमैटिन संरचना को नियंत्रित करते हैं जिसमें चार कोर हिस्टोन (एच 2 ए, एच 2 बी, एच 3 और एच 4 में से दो) 20 होते हैं। हिस्टोन में कई लाइसिन और आर्जिनिन अवशेष होते हैं, जिन्हें आसानी से संशोधित किया जाता है, जिससे व्यापक पीटीएम होते हैं जो हिस्टोन फ़ंक्शन को प्रभावित करके या अन्य सेलुलरप्रोटीन21से बंधकर क्रोमैटिन रसायन विज्ञान को बदल देते हैं। पीटीएम अग्रानुक्रम में काम करके जैविक प्रतिक्रियाओं को प्राप्त कर सकते हैं, पीटीएम के विशिष्ट समूहों के साथ कई बीमारियों में रिपोर्ट किया गया है, विशेष रूप से, कई प्रकार के कैंसर22.

जब सेलुलर स्तर पर डीएनए क्षति को पहचाना जाता है, तो यह तुरंत एक जटिल सिग्नलिंग कैस्केड की कार्रवाई के बाद होता है जहां घावों को चिह्नित किया जाता है, इसके बाद सेल चक्र प्रगति और आवश्यक मरम्मत मार्गों की सक्रियता का समन्वय होता है। इसके अलावा, डीएनए क्षति एसिटाइल और मिथाइल adducts, जो प्रोटीन भर्ती23 की सुविधा के रूप में विभिन्न संशोधनों, लाती है. डीएनए घावों में शामिल पीटीएम की महान विविधता इस सवाल की ओर ले जाती है कि ये आणविक तंत्र अपने सह-अस्तित्व को कैसे नियंत्रित करते हैं और एक अत्यंत जटिल एकीकृत नेटवर्क के माध्यम से जीनोम की अखंडता का बचाव करने का कार्यात्मक महत्व क्या है। उदाहरण के लिए, हिस्टोन एच 3 (एच 3 के 9 एमई 3) के लाइसिन 9 ट्राइमिथाइलेशन को विभिन्न रोगों24 में विभिन्न विकृति से जोड़ा गया है। इस तरह के कारणों के लिए, यह सेलुलर स्तर23 पर इन संशोधनों का पूरा लक्षण वर्णन की अनुमति है कि वाद्य विश्लेषणात्मक पद्धतियों को विकसित करने के लिए आवश्यक है.

मैनुअल डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर और प्रोटिओमिक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके हेला एस 3 हिस्टोन निष्कर्षण के विश्लेषण ने कई हिस्टोन प्रोटीन के लिए एसिटिलेशन (+42.01 दा), मिथाइल-प्रोपियोनाइलेशन (+70.04 दा), डाइमिथाइलेशन (+28.03 डीए), और ट्राइमिथाइलेशन (+42.05) सहित पीटीएम का खुलासा किया। इसके अतिरिक्त, पीएएसईएफ-आधारित एमएस / एमएस विधि एक ही पीटीएम ले जाने वाले कुछ स्थितीय आइसोमेरिक पेप्टाइड्स को अलग करने में सक्षम थी।

परिचय में, पीटीएम के अध्ययन में एलसी-टीआईएमएस-टीओएफ एमएस/एमएस को युग्मित करने के फायदे संक्षेप में वर्णित किए गए हैं ताकि अनुक्रमिक विखंडन और टक्कर-प्रेरित पृथक्करण के बाद गतिशीलता जाल में समानांतर संचय का उपयोग करके डीडीए के हाल के विकास को दिखाया जा सके। मुख्य विचार एक पद्धति स्थापित करना है जो विभिन्न पेप्टाइड्स से आने वाले संकेतों के संकल्प की अनुमति देता है और अब तक, शास्त्रीय तकनीकों को हल करने में सक्षम नहीं है। प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड का उपयोग करके व्युत्पन्न प्रक्रिया ट्रिप्सिन द्वारा लाइसिन सी-टर्मिनलों के दरार को रोकती है, जिससे लंबे, अधिक जानकारीपूर्ण पेप्टाइड्स उत्पन्न होते हैं। एक ही एम / जेड और प्रतिधारण समय के साथ पेप्टाइड्स को उनके विखंडन पैटर्न द्वारा पहचाना जा सकता था, लेकिन यह भी देखा गया कि इनमें से कुछ प्रजातियों को इस एलसी-टीआईएमएस-पीएएसईएफ-टीओएफ एमएस / एमएस विधि का उपयोग करके गतिशीलता डोमेन में अलग किया जा सकता है।

इसे बेहतर ढंग से समझने के लिए, चित्रा 8 किसी भी अणु की तीन मुख्य विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करता है, इस प्रकार एक यौगिक की पहचान की अनुमति देता है, चाहे वे बरकरार प्रोटीन, लिपिड, या पेप्टाइड्स (इस मामले में, हिस्टोन एच 3 18-26) हों, कुछ उदाहरणों को नाम देने के लिए। इन विशेषताओं में क्रोमैटोग्राफिक कॉलम में एक यौगिक का प्रतिधारण समय (मिनट), प्रत्येक यौगिक का द्रव्यमान-चार्ज अनुपात (m/z), और गतिशीलता (1/Ko) शामिल है जो ये यौगिक बहाव गैस के साथ बातचीत करते समय मौजूद होते हैं। चित्रा 8 ए में, अनमॉडिफाइड एच 3 पेप्टाइड 18-26 को 28.15 मिनट का आरटी दिखाया गया है और यह दर्शाता है कि इसकी गतिशीलता स्पेक्ट्रम में दो बैंड प्रस्तुत करता है, यह दर्शाता है कि इसमें कम से कम दो अनुरूपताएं हैं, एक परिणाम जो दो लाइसिन (18 और 23) का परिणाम होने का संदेह है जो पहले वर्णित प्रोटोकॉल के बाद प्रोपियोनाइलेट किया गया है। निम्नलिखित स्पेक्ट्रा (चित्रा 8 बी, सी) एक ही पेप्टाइड (एच 3 18-26) दिखाते हैं लेकिन बी, के 18 एसी और सी, के 23 एसी के बीच एसिटिलीकरण समूह (42.02) की स्थिति को बदलते हैं। इन दो आइसोमर्स (K18Ac और K23Ac) को मोबिलोग्राम के माध्यम से पहचाना गया है, क्योंकि वे अलग-अलग स्थानिक वितरण के साथ मौजूद हैं, जिसके परिणामस्वरूप TIMS सेल में गैस के साथ अलग-अलग इंटरैक्शन होते हैं। इस पद्धति का महत्व विभिन्न पीटीएम की अधिक विस्तार से पहचान करने और अध्ययन करने की संभावना में निहित है जो विभिन्न बीमारियों से जुड़े हुए हैं, उदाहरण के लिए, डीएनए क्षति।

जब विखंडन डेटा विरल होते हैं, तो एक विशिष्ट अवशेष पर एक संशोधन की पहचान करना चुनौतीपूर्ण होता है क्योंकि दो या दो से अधिक असमान संशोधन एक ही अवशेष पर (या निकट) एक साथ हो सकते हैं और इसे एकल संशोधन25 के रूप में समझा जा सकता है। यह सुनिश्चित करके हल किया जा सकता है कि अनमॉडिफाइड पेप्टाइड की पहचान की गई है, विशेष रूप से कई संशोधनों (तालिका 1) के बजाय एकल संशोधन की उपस्थिति की पुष्टि या इनकार करने के लिए एक मानक का उपयोग करके।

अत्यधिक संदूषण या अशुद्ध हिस्टोन के अर्क से बचने के लिए, उपयोग करने से पहले अभिकर्मकों की गुणवत्ता की जांच करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिएampले, यदि एनआईबी बफर समाधान थोक में संग्रहीत और उपयोग किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि समाधान मैलापन या असामान्य प्रस्तुति की कोई बाहरी उपस्थिति के साथ स्पष्ट है। मैलापन बैक्टीरिया के विकास का परिणाम हो सकता है, जो नमूनों को दूषित करेगा और इसके परिणामस्वरूप हिस्टोन और जीवाणु प्रोटीन का मिश्रण हो सकता है। इसके अलावा, यह बीसीए या ब्रैडफोर्ड परख प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया के रूप में assays के लिए ताजा अंशांकन घटता तैयार करने के लिए सिफारिश की है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंशांकन वक्र के लिए इस्तेमाल प्रोटीन समाप्त या नीचा नहीं है.

इस विधि को अन्य प्रकार की कोशिकाओं या जीवों तक बढ़ाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, मच्छर। पूरे या आंशिक जीवों के मामले में, उचित संख्या में जीवों का चयन करना विशेष रूप से यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि अंतिम हिस्टोन एकाग्रता विश्लेषण के लिए उपयुक्त है।

इसके अलावा, मास स्पेक्ट्रोमीटर रखरखाव के लिए एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में, सामने के छोर को समय-समय पर साफ किया जाना चाहिए ताकि उपकरण पर बिल्डअप और रनों के बीच संदूषण को रोका जा सके। इस सफाई में आवश्यकतानुसार पर्दा, छिद्र प्लेट और चौगुनी शामिल होनी चाहिए।

आम तौर पर, जब एक एलसी का उपयोग किया जाता है, तो एमएस-ग्रेड सॉल्वैंट्स का उपयोग करके प्रत्येक सप्ताह नए मोबाइल चरण (ओं) को तैयार करने पर विचार करना आवश्यक है। मोबाइल चरण की तैयारी के लिए समर्पित पिपेट और कांच के बने पदार्थ रखने और एलसी लाइनों को शुद्ध करने के लिए जब भी सिस्टम पर नए समाधान रखे जाते हैं तो यह अच्छा अभ्यास है। गार्ड और जुदाई कॉलम आमतौर पर हर 100-200 इंजेक्शन और 500-1500 इंजेक्शन, क्रमशः26 प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. नमूनों के एक बैच को चलाने से पहले और बाद में रिक्त स्थान इंजेक्ट करना सुनिश्चित करें। यदि किसी दिए गए बैच के भीतर बड़ी संख्या में नमूने हैं, तो बैच के भीतर विभिन्न अंतराल पर रिक्त स्थान चलाने पर भी विचार किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल हिस्टोन पीटीएम का पता लगाने और आयन गतिशीलता के आधार पर आइसोबैरिक और आइसोमेरिक प्रजातियों के भेदभाव के लिए पीएएसईएफ-आधारित डीडीए वर्कफ़्लो प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल व्यापक नमूना तैयार करने की आवश्यकता है, और समग्र प्रयोगात्मक नमूना तैयार करने के समय के लिए जिम्मेदार होना चाहिए. औसतन, नमूना तैयार प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए 2-3 कार्यदिवसों की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, प्रयोगशालाओं और साधन संस्करणों के बीच अंतर विश्लेषण की समग्र संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकते हैं।

बहुत कम प्रोटिओमिक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर मैनुअल समायोजन या 27,28,29 सुधार के बिना नीचे ऊपर के तरीकों के माध्यम से हिस्टोन का विश्लेषण करने में उपयोग के लिए पर्याप्त समझा गया है. परिणामों को (कम से कम पहले) मैन्युअल विश्लेषण का उपयोग करके पुष्टि की जानी चाहिए, जो समय लेने वाली भी है। यदि विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है, तो इसमें एमएस / एमएस एनोटेशन क्षमताएं होनी चाहिए, जो आमतौर पर पुष्टि या अस्वीकार करने में आसान होती हैं।

यह भी उल्लेखनीय है कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से आइसोमर्स को अलग करना असंभव है जब तक कि एक टीआईएमएस सेल डाला नहीं जाता है और गतिशीलता मूल्यों का उपयोग नहीं किया जाता है; उदाहरण के लिए, हिस्टोन संशोधनों की स्थिति विखंडन पैटर्न (PASEF) का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है।

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Disclosures

मेल्विन ए पार्क और मैथ्यू विलेट्स ब्रुकर डालटोनिक्स इंक के कर्मचारी हैं, जो टिम्सटोफ उपकरण के निर्माता हैं।

Acknowledgments

यह सामग्री राष्ट्रीय विज्ञान प्रतिष्ठान द्वारा अनुदान सं 10/2005-स्थाई के अंतर्गत समथत कार्य पर आधारित है। एचआरडी-1547798 और अनुदान सं. एचआरडी-2111661। ये एनएसएफ अनुदान फ्लोरिडा इंटरनेशनल यूनिवर्सिटी को विज्ञान और प्रौद्योगिकी (सीआरईएसटी) कार्यक्रम में अनुसंधान उत्कृष्टता केंद्र के हिस्से के रूप में प्रदान किए गए थे। यह पर्यावरण संस्थान से योगदान संख्या 1672 है, जो फ्लोरिडा इंटरनेशनल यूनिवर्सिटी में एक प्रमुख कार्यक्रम है। राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा अनुदान संख्या 10 के अंतर्गत अतिरिक्त सहायता प्रदान की गई थी। R21AI135469 फ्रांसिस्को फर्नांडीज-लीमा और ग्रांट नं। बेंजामिन ए गार्सिया के साथ-साथ राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा अनुदान संख्या के तहत R01HD106051। CHE-2127882 बेंजामिन ए. गार्सिया को। लेखक प्रारंभिक विधि विकास के दौरान डॉ मारियो गोमेज़ हर्नांडेज़ के प्रारंभिक समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 Animal Origin-Free
1 mL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060710 Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 14-282-300 Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060100 Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40 Thermo Fisher Scientific 28324 NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ (Mediatech) MT21031CM
15 mL Conical Tubes Corning 352196 Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 02-707-138 Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060310 Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610737 Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical Tubes Corning 352070 Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plate Thermo Fisher Scientific 12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μL Axygen P-DW-500-C-S
Acetone Sigma Aldrich 179124 ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN) Thermo Fisher Scientific A998 HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade Thermo Fisher Scientific LS120 Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSF Thermo Fisher Scientific 328110500 AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 Sigma Aldrich 09830 BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OH Sigma Aldrich AX1303 Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar) Airgas AR HP 300
BEH C18 HPLC column Waters 186003625 XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A7906 Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2 Sigma Aldrich C4901 Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation buffer Thermo Fisher Scientific 13151014
Ceramic scoring wafer Restek 20116
Compass DataAnalysis 6.0 Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2 Bruker Daltonics
Compass IsotopePattern Bruker Daltonics
Compass timsControl 4.1 Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 89237526
Disposable Cell Lifters Thermo Fisher Scientific  08100240 Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet Pestles Thermo Fisher Scientific 12-141-363 Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher Scientific P2325 1 M
Formic acid (FA) Sigma Aldrich 695076 ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD (Molex (Polymicro) TSP075375
Glacial Acetic Acid Thermo Fisher Scientific A38S Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur Pipettes Sigma Aldrich BR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph  Shimadzu Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HCl Sigma Aldrich 258148 ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å Thermo Fisher Scientific 60106-402
Hypersep cartridge Thermo Fisher Scientific 60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF Agilent G1969-85000 TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLC Thermo Fisher Scientific A454 Optima for HPLC, Fisher Chemical  
Microcentrifuge Tube Adapters GL Sciences 501021514
Microcystin Thermo Fisher Scientific 50-200-8727 Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm LEAP PAL Parts LAP.11190933
Nanodrop Thermo Fisher Scientific model: ND3300
Nitrogen (N2) Airgas NI UHP300
PEAKS Studio X+ Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, Instachek Micro Essential Lab JR-113 Model: Hydrion
Potassium chloride, KCl Sigma Aldrich P3911 ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection Cell Next Advance  model: PC77
Propionic Anhydride Sigma Aldrich 8.00608 For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) NuAire, model: Nuwind NU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g ESI Source Solutions r13.aq.0003
SDS-PAGE Gels Bio-Rad 4569035 Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrate Thermo Fisher Scientific A11079.06 98+%
Sodium chloride, NaCl Sigma Aldrich S9888 ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18 VWR 76333-134 Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor Savant model: SC210A
Sucrose Millipore 1.07651 suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4  Sigma Aldrich 339741 99.999%
TIMS-ToF Mass Spectrometer Bruker Daltonics model Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCA Sigma Aldrich T0699 6.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Aldrich 302031 Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa Nanomate Advion model: TR263
TrypsinProtease, MS Grade Thermo Fisher Scientific 90057
Tube rotator Thermo Fisher Scientific 88881001
Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific 88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade Thermo Fisher Scientific LS118 Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific 

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References

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रसायन विज्ञान अंक 203
तरल क्रोमैटोग्राफी, ट्रैप्ड आयन मोबिलिटी स्पेक्ट्रोमेट्री, और टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके हिस्टोन संशोधन स्क्रीनिंग
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Fernandez-Rojas, M., Fuller, C. N., Valadares Tose, L., Willetts, M., Park, M. A., Bhanu, N. V., Garcia, B. A., Fernandez-Lima, F. Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (203), e65589, doi:10.3791/65589 (2024).

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