Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

בדיקת שינוי היסטון באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה בזמן טיסה

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65589
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

Summary

תהליך עבודה אנליטי המבוסס על כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה של זמן טיסה (LC-TIMS-ToF MS/MS) לביטחון גבוה וניתוח "מלמטה למעלה" בעל יכולת שחזור גבוהה של שינויים וזיהוי של היסטון בהתבסס על פרמטרים עיקריים (זמן שמירה [RT], חתך התנגשות [CCS] ויחס מסה למטען מדויק [m/z]).

Abstract

חלבוני היסטון נפוצים מאוד ונשמרים בקרב האיקריוטים וממלאים תפקיד גדול בבקרת גנים כתוצאה ממבנים הידועים כשינויים פוסט-תרגומיים (PTM). זיהוי המיקום והאופי של כל PTM או תבנית של PTM ביחס לגורמים חיצוניים או גנטיים מאפשר למידע זה להיות מתואם סטטיסטית עם תגובות ביולוגיות כגון שעתוק DNA, שכפול או תיקון. בעבודה הנוכחית מתואר פרוטוקול אנליטי בתפוקה גבוהה לזיהוי PTM היסטון מדגימות ביולוגיות. השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית משלימה, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסות זמן טיסה (LC-TIMS-ToF MS/MS) מאפשר הפרדה והקצאה של PTM של השינויים הרלוונטיים ביותר מבחינה ביולוגית באנליזה יחידה. הגישה המתוארת מנצלת את ההתפתחויות האחרונות ברכישת נתונים תלויים (DDA) באמצעות הצטברות מקבילית במלכודת הניידות, ואחריה פיצול רציף ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות. רכיבי Histone PTM מוקצים בבטחה בהתבסס על זמן השמירה, הניידות ודפוס הפיצול שלהם.

Introduction

בתאים איקריוטים, דנ"א ארוז ככרומטין ליחידות פונקציונליות הנקראות נוקלאוזומים. יחידות אלה מורכבות מאוקטמר של ארבעה אבני ליבה (שניים כל אחד מ-H2A, H2B, H3 ו-H4)1,2,3,4. היסטונים הם בין החלבונים הנפוצים והשמורים ביותר באיקריוטים, האחראים במידה רבה לבקרת גנים5. שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון (PTM) ממלאים תפקיד גדול בוויסות הדינמיקה של הכרומטין ובתהליכים ביולוגיים שונים כגון שעתוק DNA, שכפול ותיקון6. PTMs מתרחשים בעיקר על פני השטח הנגישים של אזורי N-terminal של היסטונים הבאים במגע עם DNA 3,7. עם זאת, שינויים בזנב ובליבה משפיעים על מבנה הכרומטין, משנים אינטראקציות בין נוקלאוזומים ומגייסים חלבונים ספציפיים 3,8.

אתגר עכשווי במהלך פרוטאומטריה מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS) מבוססת פרוטאומיקה הוא שיתוף הפעולה הפוטנציאלי של אנליטים בעלי עניין. במקרה של ניתוחים תלויי נתונים (DDA), זה מתורגם לאובדן פוטנציאלי של מספר יונים מקדימים במהלך תהליך רכישת MS/MS9. מכשירי זמן טיסה (ToF) רוכשים ספקטרום בתדר גבוה מאוד 9,10 (עד עשרות קילוהרץ)11; זה הופך אותם למסוגלים לסרוק במהירות את סך כל היונים המקדימים בתוך מדגם מורכב (MS1), ובכך להבטיח רגישות אופטימלית וקצבי ריצוף MS/MS (עד 100 הרץ)9 ולהפוך אותם לאידיאליים לניתוח דגימה ביולוגית10. עם זאת, הרגישות הזמינה בקצבי סריקה גבוהים אלה מוגבלת על ידי קצב MS/MS9. התוספת של ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים (TIMS) בשילוב עם ספקטרומטר מסות זמן טיסה מרובע אורתוגונלי (qToF) שימשה למיתון מגבלות אלה. ב-TIMS, כל היונים המקדימים נצברים יחד ומדוללים כפונקציה של הניידות שלהם, במקום לבחור מסות מקדימות בודדות עם9 מרובע. פיצול טורי מצטבר מקבילי (PASEF) מאפשר מאות אירועי MS/MS בשנייה ללא כל אובדן רגישות9.

המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה להראות את ההתפתחויות האחרונות של DDA באמצעות הצטברות מקבילית במלכודת הניידות ואחריה פיצול רציף ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID). PTMs היסטון הוקצו בביטחון בהתבסס על זמני השמירה שלהם (RTs), ניידות ודפוסי פיצול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: דגימות היסטון חולצו בשיטה שאומצה מ- Bhanu et al. (2020)12.

1. הכנת מדגם

  1. קצירת תאים בתרבית
    1. כאשר התאים נפגשים ב-80%, ודא שהם בני קיימא באמצעות הרחקת טריפאן כחול.
      הערה: קו תאי HeLa S3 שימש לניסויים אלה, אך ניתן ליישם שיטה זו על כל תא בתרבית.
    2. יש לשאוף את המדיה, ולאחר מכן למרוח 5 מ"ל של 1x מלח חוצץ פוספט (PBS) על כל צלחת.
    3. סובבו את הצלחות כדי לשטוף את כל שאריות המדיה, ואז שאפו PBS ומרחו 5 מ"ל של 1x PBS.
    4. הפרידו בעדינות את התאים מהצלחת על ידי גירודם עם מרים תאים חד פעמי.
    5. מעבירים כל תרחיף תא לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    6. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות.
    7. שאפו את PBS מכדורית התא.
    8. המשך למיצוי היסטון.
      הערה: יש להקפיא במהירות הבזק את כדורית התא בחנקן נוזלי אם לא ניתן לעבד אותה באופן מיידי. אחסנו את הכדוריות בטמפרטורה של -80°C עד שהן מוכנות להמשך.
  2. מיצוי היסטון
    1. להעריך את הנפח של כל כדור תא ולסמן את המניסקוס עם סמן קבוע.
    2. הכינו מספיק מאגר בידוד גרעיני (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 ו-250 mM סוכרוז) עבור כל הדגימות. לחלופין, אם יש צורך לעבד דגימות רבות לאורך זמן, יש ליצור את החיץ בכמויות גדולות ולאחסן בטמפרטורה של 2-8°C למשך עד 6 חודשים, או ליצור aliquot ולהקפיא ב-15°C עד -25°C ללא הגבלת זמן על ידי הפשרת הכמות הדרושה לכל מיצוי בלבד.
      הערה: המאגר צריך להישאר נקי במהלך האחסון. אם המאגר מקבל מראה מעונן או חריג אחר בכל עת, השליכו והכינו מאגר חדש.
    3. הכינו פי 50 מנפח כדורי התא של חיץ השטיפה והוסיפו מעכבים כדלקמן (כ-10 מ"ל חיץ שטיפה לכל 2 דגימות).
      1. להכנת 10 מ"ל של חיץ כביסה, יש לערבב 10 מ"ל של NIB, 30 μL של 200 מ"מ 4-(2-אמינואתיל)בנזנסולפוניל פלואוריד הידרוכלוריד [AEBSF], 10 μL של 1 M dithiothreitol [DTT], 20 μL של 5 מיקרוציסטין 5 מיקרו, 20 μL של 5 M נתרן בוטיראט.
    4. הסר 1/5 ממאגר הכביסה כדי להכין את חיץ הליזיס (1/5 נפח ממאגר הכביסה, 0.3% NP-40 או NP-40 חלופי).
      הערה: אל תשתמש ב- Triton-X 100 במקום בחלופה NP-40 או NP-40, מכיוון שהוא עשוי להיות שוחק מדי עבור סוגי תאים מסוימים.
    5. שטפו היטב את גלולת התא על ידי השעייתה ב-5 עמודות של חיץ כביסה וצנטריפוגות בטמפרטורה של 800 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. השלימו שלב זה פעמיים, שאפו והשליכו את הסופרנאטנט בין הכביסה.
    6. ודא שנפח גלולת התא עדיין מסומן בטוש קבוע. השהיה מחדש ב-10 כרכים של מאגר ליזיס.
    7. פיפטה - מערבבים היטב כל גלולה להשעיה מחדש, ואז דוגרים במשך 15 דקות על קרח.
    8. לאחר 15 דקות, צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
    9. שאפו והשליכו את הסופר-נאנט.
      הערה: הגלולה צריכה להקטין עד ≤ 1/2 מגודל הגלולה המקורי (כפי שמצוין בקו הסמן). אם הגלולה לא הצטמצמה מספיק, חזור על הליך הליזיס וכלול שלב הומוגניזציה עדין באמצעות מזיק כדי לפתוח את התאים.
    10. לאחר השלמת הליזה, השהה מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של חיץ שטיפה, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שאפו והשליכו את הסופרנטנט, ואז חזרו על שלב הכביסה פעם נוספת כדי להסיר את כל העקבות של NP-40.
      הערה: בשלב זה, הגלולה מורכבת מכרומטין, המכיל היסטונים.
    11. השהה מחדש את הגלולה ב -5 כרכים (מגודל גלולת התא המקורית) של 0.4 N H2SO4.
    12. יש לדגור במשך שעתיים בחדר קר או במקרר באמצעות מתסיס.
    13. לאחר שעתיים, צנטריפוגה את הדגימה (ים) ב 3400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. אל תשליך את הסופר-נטנט.
    14. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות חדשים, ומזנקים 100% חומצה טריכלורואצטית (TCA) ל-1/3 מנפח התכולה (ריכוז ה-TCA הסופי יהיה כ-20%).
    15. הפכו בעדינות את הצינור ושימו לב שהתמיסה השקופה וחסרת הצבע הופכת ללבנה ו/או מעוננת, מה שמעיד על משקעים חלבוניים.
      הערה: עבור תמיסות עם ריכוזי היסטון נמוכים, משקעי החלבון עשויים שלא להיות מורגשים באופן מיידי, אך המשקע צריך להיות גלוי לאחר הדגירה בלילה.
    16. יש לדגור ללא הפרעה למשך הלילה (12-18 שעות) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לזרז לחלוטין את חלבוני ההיסטון.
    17. למחרת, צנטריפוגה ב 3400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
    18. שואפים את הסופרנטנט, נזהרים לא לגעת בצידי הצינור עם קצה הפיפטה. בשלב זה, ההיסטונים מופקדים בעיקר כסרט סביב צידי הצינור(ים).
    19. הוסף 500 μL של אצטון קר כקרח + 0.1% HCl (חומצה אצטון) לכל צינור, באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, ולאחר מכן להפוך בעדינות את הצינור(ים) מספר פעמים. סדרו את הדגימות בסדר (1, 2, 3 וכו') תוך כדי כך, שכן כל אצטון תועה עלול להסיר את הסימונים על הצינורות. צנטריפוגה ב 3400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C בעדינות decant את supernatant.
    20. חזור על שלב שטיפה זה עם 500 μL של 100% אצטון קר כקרח, גם עם פיפטה פסטר זכוכית. צנטריפוגה ב 3400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C בעדינות decant את supernatant.
    21. השאירו את הצינורות פתוחים לייבוש בטמפרטורת החדר עד שהאצטון שנותר יתאדה.
    22. כאשר יבש, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של מים ברמת ספקטרומטריית מסה (MS) לכל צינור. השתמש בטיפה זו כדי לספוג את כל צידי המיכל כדי להשהות מחדש את כל סרט ההיסטון. עשו זאת על ידי הצמדת הטיפה לצד הצינור וסיבובה תוך כדי פיטום למעלה ולמטה או ניפוק מחצית מ-100 מיקרוליטר ושימוש בקצה כדי לערבב אותה מסביב. שילוב של שתי השיטות עובד בצורה הטובה ביותר. היסטונים מסיסים בקלות במים ויהיו בתמיסה.
    23. לאחר השעיית כל הדגימות, אם נותר מוצק לבן, יש להסוניק באמבטיה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    24. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. העבירו את התמיסה השקופה לצינורות טריים. יש להשליך את כל הכדורים הבלתי מסיסים שנותרו.
    25. הפעל SDS-PAGE בתנאים מחמירים כדי לוודא שהחילוץ נקי.
      הערה: ניתן להפעיל ג'לים באמצעות כל ריכוז מתאים של פוליאקרילאמיד כל עוד הוא יכול להבדיל חלבונים בטווח של 10-20 kDa. עיין בטבלת החומרים עבור הג'לים המשמשים בפרוטוקול זה.
    26. בצע בדיקת ריכוז חלבון (כלומר, ברדפורד או BCA) כדי לקבוע את ריכוז החלבון הכולל.
  3. derivatization כימי (propionylation) של שאריות ליזין
    1. מעבירים 20 מיקרוגרם של היסטונים (נקבעים על ידי בדיקת החלבון) לצינור נקי. יבש דגימה זו עד <5 μL באמצעות רכז ואקום, ולאחר מכן השהה מחדש באמצעות 20 μL של 100 mM אמוניום ביקרבונט (NH4CO3) (~ 1 מיקרוגרם / תמיסת μL). התאם את ה- pH ל~8 באמצעות אמוניום הידרוקסיד במידת הצורך.
      אזהרה: אין להשתמש באמוניום הידרוקסיד (NH4OH) להשעיה מחדש, אלא רק כדי לכוונן את רמת החומציות במידת הצורך. אחרת, חלבונים יהיה denature ו לזרז.
      הערה: כדי לבדוק את רמת החומציות עם אובדן דגימה מינימלי, השתמש בקצה פיפטה כדי לטבול את הדגימה ולטפוח על רצועת pH. הליך בדיקה זה יהיה שימושי לאורך שלבי הכנת הדגימה הנותרים.
    2. הכינו את מגיב הפרופיונילציה על ידי הוספת אנהידריד פרופיוני לאצטוניטריל (ACN) ביחס של 1:3 (v/v) (כלומר, כדי ליצור 40 מיקרוליטר של מגיב, שלבו 10 מיקרוליטר של אנהידריד פרופיוני עם 30 מיקרוליטר של ACN).
      הערה: באופן מסורתי, מתנול או איזופרופנול שימשו להכנת מגיב פרופיונילציה. מכיוון שפרופיונילציה היא תגובת היווצרות אמיד, נדרש ממס לא פרוטוני, כמו אצטוניטריל, כדי למנוע תוצרי לוואי ותגובות לא רצויות, כגון מתיל פרופיוניל אסטר, הנובע משימוש במתנול. רק להכין מספיק מגיב propionylation עבור עד 4 דגימות בכל פעם, כך מגיב נשאר טרי. השתמש מגיב בתוך 1-2 דקות של הכנה. כאשר המגיב יושב, אנהידריד פרופיוני יגיב עם כל לחות הסביבה, וחומצה אצטית תתחיל להיווצר, אשר יכולה לשנות את האפקטיביות של מגיב וישנה את ה- pH של תמיסת היסטון לאחר הוספת המגיב.
    3. הוסף מגיב פרופיונילציה לכל דגימה ביחס של 1:4 (v/v) (כלומר, עבור 20 μL של היסטונים, הוסף 5 μL של מגיב פרופיונילציה).
    4. הוסף במהירות 1:5 (v/v) NH4OH (כלומר, הוסף 4 μL עבור 20 μL של תמיסת ההיסטון) כדי לבסס מחדש את ה- pH של התמיסה ל~8. אם ה- pH עדיין נמוך מדי, הוסף 1-2 μL של NH4OH בכל פעם עד להשגת pH של 8. בדרך כלל, יחס של 1:5 (v/v) הוא מספיק.
    5. יש לדגור על הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ללא הפרעה.
    6. חזור על תגובת הפרופיונילציה עבור לא יותר מ 3-4 דגימות לכל אצווה של מגיב פרופיונילציה כדי להבטיח היווצרות חומצה מינימלית.
    7. חזור על הליך הפרופיונילציה שלבים 1.3.2-1.3.5. סבב שני של פרופיונילציה מבטיח כי >95% מהליזין הזמין יעברו דה-ריווטציה.
    8. יבש את הדגימות עד <5 μL באמצעות רכז ואקום. פעולה זו תאדה כל מגיב פרופיונילציה, מוצרי חומצה וגז אמוניה המשתחררים מ- NH4OH. אם הדגימות מתייבשות לחלוטין, זה בסדר, מכיוון שלא מתרחשים הפסדי דגימה משמעותיים.
      הערה: יש להחליף את האוויר בבקבוק האנהידריד הפרופיוני עם גז ארגון לפני האחסון כדי למנוע היווצרות חומצה אצטית עקב מגע עם לחות הסביבה שנותרה בבקבוק.
  4. עיכול פרוטאוליטי עם טריפסין
    1. מרחפים מחדש את ההיסטונים ב-100 mM NH4HCO3 כדי להגיע לנפח של 20 μL, ולהשיג ריכוז אופטימלי של 1 מיקרוגרם/μL.
      הערה: תמיסות לדוגמה עם ריכוזים נמוכים מ-1 מיקרוגרם/מיקרוליטר יגרמו לירידה ביעילות הטריפסין.
    2. הוסף טריפסין לדגימות היסטון ביחס של 1:10 (wt/wt) (כלומר, הוסף 2 μL של תמיסת 1 מיקרוגרם/μL של טריפסין ל-20 מיקרוגרם של היסטונים).
    3. יש לדגור על תגובות בטמפרטורה של 37°C למשך 6-8 שעות. לחלופין, יש לדגור למשך הלילה (12-18 שעות) בטמפרטורת החדר.
    4. עצור את העיכול על ידי הקפאה ב -80 ° C לפחות 1 שעה.
      הערה: אין להשתמש בחומצה כדי להרוות את תגובת העיכול, מכיוון שהדבר יגרום לירידה לא רצויה ב- pH בשלב זה של ההליך. ניתן לאחסן את הדגימה ב -80 ° C עד מוכן להמשיך (נקודת עצירה ביניים).
  5. derivatization כימי (propionylation) של פפטיד N-terminals
    1. יבש את הדגימות ל <5 μL באמצעות רכז ואקום.
    2. השהה מחדש את הדגימות עד 20 μL (1 מיקרוגרם/μL) באמצעות 100 mM NH4HCO3.
    3. חזור על פרופיונילציה כמו קודם (שלב 1.3).
      הערה: זה נורמלי שלדגימות לוקח יותר זמן להתייבש בשלב זה בגלל יחס פאזה מימי: אורגני גבוה יותר.
  6. התפלה לדוגמה עם עצות שלב
    1. יש להשהות או לדלל דגימות עם 50 מיקרוליטר מים ברמת MS + 0.1% TFA.
    2. באמצעות קורר מדגם 11-G, ניקב 5 דיסקים של חומר C18 מדיסק חילוץ פאזה מוצקה (ניקוב כל 5 הדיסקים לפני העברתם לקצה פיפטה). הכנס וודא שהדיסקים מחוברים בצורה מאובטחת ואחידה בתחתית קצה פיפטה של 200 μL (איור 1).
      הערה: יש להשתמש בקורר של 15 גרם אם מתפלים מעל 25 מיקרוגרם דגימה דרך קצה שלב יחיד.
    3. השתמש במתאם צנטריפוגות כדי להחזיק את קצות הבמה במקומם בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל או 2 מ"ל.
      הערה: עבור שלבי הצנטריפוגה הבאים, השתמש בסיבוב איטי (400-500 x גרם) ב- 4 ° C, למשך 1-2 דקות בכל פעם; הממסים בדרך כלל עוברים דרך השרף תוך פחות מדקה, תלוי עד כמה החומר C18 ארוז בקצוות.
    4. שטפו את השרף על ידי צנטריפוגה עם 50 μL של 100% אצטוניטריל כדי להפעיל את החומר C18 ולהסיר מזהמים פוטנציאליים.
      הערה: ייתכן שיהיה קל יותר להעמיס פתרונות על קצות הבמה באמצעות קצוות פיפטה להעמסת ג'ל. לאחר הפעלת חומר C18 , חשוב לא לאפשר לשרף להתייבש למשך הליך ההתפלה.
    5. אזנו את חומר הדיסק עם 80 מיקרוליטר מים ברמת MS + 0.1% TFA על ידי צנטריפוגה.
    6. חומצי את הדגימה ל- pH 4 או נמוך יותר באמצעות חומצה אצטית קרחונית. בדוק את ה- pH עם רצועות pH כמו בעבר כדי למזער את אובדן הדגימה.
    7. טען את כל הדגימה על דיסק השרף על ידי צנטריפוגה איטית.
    8. לשטוף את הדגימה עם 80 μL של מים כיתה MS + 0.1% TFA על ידי צנטריפוגה.
    9. יש להכניס את הדגימה לצינור נקי של 1.5 מ"ל על ידי שטיפה של 70 מיקרוליטר של 75% אצטוניטריל ו-0.5% חומצה אצטית על ידי צנטריפוגה איטית. ניתן להשתמש בזמן צנטריפוגה נוסף כדי להבטיח שנפח הדגימה המלא מדולל מקצה הבמה. זה בסדר אם השרף מתייבש עם זמן הצנטריפוגה הנוסף, מכיוון שהוא כבר לא נחוץ מעבר לפליטת הדגימה.
    10. יבשו כל דגימה לחלוטין ברכז ואקום.
      הערה: ניתן לאחסן דוגמאות בטמפרטורה של -80°C עד שהן מוכנות להמשיך (נקודת עצירת ביניים).
    11. לניתוח LC-MS/MS, יש לשחזר את הדגימות בנפח של ממס A (0.1% חומצה פורמית) מפרוטוקול הכרומטוגרפיה הנוזלית (LC) הנותן את הריכוז הסופי של 0.4 מיקרוגרם/מיקרוליטר (כלומר, להמיס 20 מיקרוגרם של היסטונים ב-50 מיקרוליטר של ממס A).

2. ממשק תוכנת TIMS

  1. בחר בכרטיסיה לוח מחוונים ועבור להפעלה (ודא ששם המכשיר מסומן בירוק) (איור 2).
  2. אמת פרמטרים של TIMS (איור 2).
  3. אמת את הגדרות MS (תחילת סריקה, סוף סריקה, קוטביות יונים, מצב סריקה) (איור 2).
  4. אמת הגדרות TIMS (מצב, התחלת ניידות, סיום ניידות, זמן רמפה, זמן צבירה, מחזור פעילות, קצב רמפה, קצב MS, ממוצע MS וכיול אוטומטי) (איור 2).
  5. עבור אל הכרטיסייה מקור והפעל את אפשרות המזרק (Hamilton 500 μL) רק עבור שלב הכיול של TuneMix (איור 3)13.
  6. עבור אל הכרטיסיה כיול , לחץ על m/z, בחר מצב כיול ובחר את המצב (Q משופר, באופן כללי), זום (+0.01%) STD Dev (0.24) ולחץ על כיול; כאשר משיגים ציון של 100%, מקבלים (תרשים 4).
  7. עבור אל כרטיסיית הניידות וחזור על תהליך הכיול (מצב ליניארי, באופן כללי), טווח זיהוי ( +5%), רוחב (0.1 Da), STD Dev (0.1855) ולאחר מכן לחץ על כיול; כאשר אתם מקבלים ציון ≥ 98.5%, קבלו (תרשים 5).
  8. עבור אל השיטה ובחר את השיטה לשימוש; עבור דוגמה זו, נבחרה Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl (איור 5).

3. LC-TIMS-PASEF-TOF MS/MS

  1. השתמש בתנאי ההפעלה האופייניים של nESI: מתח נימי של 4500 וולט, היסט לוח קצה של 800 וולט, לחץ נבולייזר של 3.0 בר, גז יבש של 10.0 ליטר לדקה, מחמם יבש של 200 מעלות צלזיוס וקצב זרימה של הזרקה של 50 מיקרוליטר לדקה.
  2. השתמש בהגדרות MS טיפוסיות: אנרגיית התנגשות 6 eV, RF התנגשות 1200 Vpp, זמן העברה של 75 μs, אחסון דחף של 5 μs.
  3. קבע את זרימת גז הסחף באמצעות הפרש הלחצים ממשפך הכניסה P1 ומשפך היציאה P2. פיצול טורי-צבירה מקבילית (PASEF) מתרחש בתא TIMS, וצובר את כל היונים המקדימים בו זמנית ולא בנפרד. לאחר מכן יונים מקדימים משתחררים בפסגות יונים צרות לעומת פסגות רחבות בהרבה בדרך כלל (קצרות בערך פי 50), מה שמגדיל את יחס האות לרעש תוך הפרדת פפטידים פולטים באמצעות ניידות14.
  4. פיתוח שיטת LC-TIMS-ToF MS/MS לניתוח פפטידי היסטון פרוטאוליטיים. שלב כרומטוגרף נוזלי בעל ביצועים גבוהים (HPLC) המצויד בעמוד C18 (300 Å, 5 מיקרומטר, 4.6 מ"מ x 250 מ"מ) עם מכשיר TIMS-TOF MS מסחרי עם טכנולוגיית PASEF קניינית.
    הערה: גודל עמודה זה נקבע כמספק הפרדה טובה ב- pH גבוה ונמוך עבור תערובות פפטידים, בהתבסס על עבודות שפורסמו בעבר 15,16,17.
    1. הגדר את נפח ההזרקה ל- 20 μL (8 מיקרוגרם) של דגימה וקצב זרימה של 0.4 מ"ל לדקה.
    2. הפעל שיפוע LC לא ליניארי של 60 דקות באמצעות מים עם 0.1% חומצה פורמית (ממס A) ואצטוניטריל עם 0.1% חומצה פורמית (ממס B). הגדר את השיפוע: 10% B למשך 2.7 דקות, ואז ל- 20% B ב- 5.3 דקות, 28% B ב- 4 דקות, 35% B ב- 18 דקות נוספות, ל- 40% B ב- 13 דקות, ו- 100% B ב- 2 דקות נוספות. לאחר החזקת 100% B במשך 5 דקות, להוריד את הריכוז ל 10% B ב 5 דקות ולהחזיק במשך 5 הדקות האחרונות.
  5. אמת את פליטת הדגימה מה-HPLC לתוך TIMS-TOF באמצעות יינון ננו-אלקטרוספריי (nESI) במצב יינון חיובי.

4. ניתוח נתונים

  1. זהה את רצפי הפפטידים ואת אתרי השינוי.
    1. הכינו רשימה תיאורטית של פפטידים באמצעות ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] תחת הכלי MS-digest.
      1. בצע תקציר תיאורטי תוך התחשבות בתנאי העיכול (האנזים שבו נעשה שימוש), סוגי PTM שמחפשים (למשל, מונו, די או טרימתילציה), טווח הגדלים של הפפטידים שמחפשים, כמו גם טווח זיהוי המסה והמספר הפוטנציאלי של מחשופים שהוחמצו.
  2. נתח ידנית את הנתונים שנרכשו בהתבסס על פפטידים תיאורטיים (איור 6)12.
    1. חפש את המסות במספר מצבי מטען (+1 עד +4) עבור כל פפטיד תיאורטי.
    2. לאחר הזיהוי הראשוני של כל m/z, בחר את הפסגה ואשר את MS/MS באמצעות רשימה תיאורטית של יוני פיצול המבוססים על רצף הפפטידים, כולל PTM.
      הערה: אם הניידות של הפפטיד שזוהה הייתה ידועה בעבר, גם זה אושר.
  3. חשב את השפע היחסי של PTM שונים ודווח על כל שינוי כאחוז מרצף הפפטידים שצוין.
    1. השפע היחסי של כל PTM שזוהה מחושב באמצעות המשוואה הבאה:
      שפע יחסי = שטח PTM/שטח כולל של PTM ללא שינוי ו- PTM עבור פפטיד נתון

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תהליך עבודה פרוטאומי מלמטה למעלה (איור 7) כולל בדרך כלל את הדברים הבאים: מיצוי חלבוני המטרה מדגימה גולמית, ולאחר מכן כימות ריכוז החלבונים, ולאחר מכן שבירה, בדרך כלל באמצעות אלקטרופורזה בג'ל או כרומטוגרפיה נוזלית. לאחר השבירה, החלבונים מתעכלים באמצעות אנזים פרוטאוליטי (לעתים קרובות טריפסין), ולבסוף, ניתוח ספקטרומטרי מסה של הפפטידים המתקבלים וזיהוי חלבונים באמצעות מסד נתונים מבוסס18. מידע על רצף נגזר מיונים מקדימים בטווח המסה למטען (m/z) שצוין, אשר נתונים לדיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID), ומייצרים תבניות פיצול שיש לזהות ולרצף באמצעות מסד נתונים19 (איור 8).

עבור עבודה זו, המטרה העיקרית הייתה לפתח וליישם שיטת LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA בעקבות השלבים שתוארו קודם לכן בסעיף הפרוטוקול. קביעת המיקום של שינויים לאחר תרגום על פפטידים איזומריים ואיזובריים הציבה אתגר מיוחד בנוגע לזיהוי ופרשנות ספקטרום. במחקר זה, תקני היסטון אנושיים רקומביננטיים ותאי HeLa S3 שימשו כדגימות.

ניתוח Histone PTM של תקני היסטון אנושיים באמצעות ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS הניב פפטידים בגודל בינוני עד גדול (3-30 חומצות אמינו באורך) שזוהו עם עד 5 מטענים לכל פפטיד. הליך הפרופיונילציה הצליח לייצר פפטידים ארוכים ואינפורמטיביים יותר מאלה המיוצרים בדרך כלל על ידי עיכול טריפטי. לאחר ניתוח הנתונים, פפטידים זוהו במצבים שונים שהשתנו. כיתרון, השיטה מבוססת TIMS הבדילה בין כמה פפטידים איזומריים מיקום הנושאים את אותם PTM. לדוגמה, שני מינים איזומריים עשויים לחפוף בזמן השמירה וב-m/z; אולם ניתן היה להפריד בין שני האותות בתחום הניידות (איור 9).

ספקטרום הפיצול המתאים עבור הפפטידים המוצגים באיור 9 הוסבר על-ידי תוכנת ניתוח פרוטאומית באמצעות קובצי FASTA המתאימים. באיור 9A, הפפטיד שלא שונה נראה עם שלוש קבוצות פרופיוניל (+56.03) (בטרמינל N, ליזין 18 וליזין 23). באיור 9B, הפפטיד נצפה עם קבוצת אצטיל (+42.02) על ליזין 18 ושתי קבוצות פרופיוניל (אחת בטרמינל N ואחת בליזין 23). לבסוף, באיור 9C הפפטיד נראה עם אצטילציה שנצפתה על ליזין 23 ושתי קבוצות פרופיוניל (על N-terminal וליזין 18). כפי שפורסם בעבר, יתרון PASEF יכול לשמש להגברת מהירות ורגישות הרצף על ידי מיקוד אותה תכונה שוב ושוב9. זה מאפשר למשתמש לקבל מידע מבני יותר מדגימות ביולוגיות. במקרה זה, זה מוחל על סוג ומיקום של PTMs המתרחשים על כל היסטון.

ניתוח שינויים לאחר תרגום יכול להיות מיוצג גם באופן חזותי כתרשים כיסוי רצף, כפי שניתן לראות באיור 10. באיור 10A, תקן H3 של היסטון שעבר פרופיונילציה לפני העיכול, מציג פפטידים ארוכים יותר ממה שהיה נוצר אחרת, מסומנים על-ידי הקווים הכחולים. היסטונים שהופקו מתאי HeLa S3 עובדו באותו אופן, כפי שמיוצג על-ידי איור 10B. צוינו מספר PTMs, כולל דפוסים רבים ושונים באותן עמדות של חומצות אמינו. זה צפוי מדגימות ביולוגיות. יש לציין כי הקווים האפורים המעטים באיור 10B מציינים פפטידים שזוהו באופן מעורפל בשל היעדר MS2 כתוצאה מהעוצמה הנמוכה.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי והפקה של קצות במה. (A-G) מדריך שלב אחר שלב לייצור קצה שלב דיסק סיליקה C18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עיבוד נתונים: 20210804 היסטונים סטנדרטיים פרופיונילציה Mix_QC פפטיד. לפני שתתחיל לעבד את הנתונים, הקפד להכין את הרשימה התיאורטית של מצבי מטען אפשריים ופיצוליהם (1550.9013; 775.9543; 517.6386; וכו ') כדי לחלץ ערכים אלה מכרומטוגרמה שיא הבסיס (BPC + All MS). לאחר חילוץ כל פפטיד ודא שהוא נראה כמו רשימת הניתוח המוצגת באיור. השיא 775.9543 נבחר כדוגמה. בצד ימין של האיור מוצגים שלושה גרפים: הראשון מתאים לכרומטוגרמה (גרף עוצמה לעומת זמן), השני למובילוגרמה, והשלישי לספקטרום המסות עם פיצול PASEF כלול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פרוטוקול timsControl שלבים 1-4. האיור מציג את ארבעת השלבים הראשונים של הליך timsControl. בצד שמאל למעלה, לחץ על לחצן לוח המחוונים כדי להפעיל ולכבות את החיבור בין המכשיר לתוכנה. לפני ביצוע משימה כלשהי, יש לוודא כי התוכנה נמצאת במצב הפעלה. לבסוף, ודא שהפרמטרים של TIMS נכונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פרמטרי מקור. במקרה זה, מזרק המילטון 500 μL שימש רק עבור TuneMix. ודא שהפרמטרים האחרים נשארים נכונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: כיול מסה לטעינה (m/z). בחר כיול עד לקבלת ציון של 100% במצב כיול בלוח השמאלי התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: כיול ניידות. בחר כיול עד לקבלת ציון של 98.5% לפחות במצב כיול בלוח השמאלי התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: זרימת עבודה טיפוסית של פרוטאומיקה מלמטה למעלה. שלב אחר שלב של ההליכים מלמטה למעלה מהכנת הדגימה ועד לזיהוי9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: זמן שמירה, תבנית איזוטופית ופרופילי ניידות H3 18-26. (A) פרופיונילציה ללא שינוי, (B) פפטיד K23Ac פרופיונילציה בשתי העמדות האחרות, ו-(C) פרופיונילציה K18Ac בשתי העמדות האחרות. שים לב ליתרונות של הפרדת הניידות במקרה של האיזומרים המבניים המוצגים בלוחות B ו- C. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: דוגמה לריצוף פפטידי פיצול MS/MS באמצעות PASEF. ספקטרום פרגמנטים התקבלו מתוכנת אנליזה פרוטאומית עבור פפטיד H3 עם מיקומי חומצות אמינו 18-26. (A) פרופיונילציה ללא שינוי, (B) פרופיונילציה פפטיד K23Ac בשתי העמדות האחרות, ו-(C) פרופיונילציה K18Ac בשתי העמדות האחרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: דוגמה לסיכום ניתוח PTM חזותי של היסטון. תוצאות של פפטידים ו-PTMs שנצפו מ-(A) תקן H3 ו-(B) H3 מתאי HeLa S3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מאפיינים סטנדרטיים ופפטיד HeLa S3 LC-TIMS-ToF MS/MS. רשימת פפטידים ממוקדים ונצפים, כולל תכונות ניסוי (כלומר, זמן שמירה, m/z, 1/Ko ואזורי שיא LC). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היסטונים הם חלבונים בסיסיים המווסתים את מבנה הכרומטין על ידי אינטראקציה עם דנ"א בצורה של אוקטמרים המורכבים מארבעת אבני הליבה (שניים כל אחד מ-H2A, H2B, H3 ו-H4)20. היסטונים מכילים שאריות ליזין וארגינין רבות, אשר משתנות בקלות, מה שמוביל ל-PTM נרחב המשנה את הכימיה של הכרומטין על ידי השפעה על תפקוד ההיסטון או על ידי קשירה לחלבונים תאיים אחרים21. PTMs יכולים לעורר תגובות ביולוגיות על ידי עבודה במקביל, כאשר קבוצות ספציפיות של PTMs דווחו במספר מחלות, בעיקר, מספר סוגים של סרטן22.

כאשר נזק לדנ"א מזוהה ברמה התאית, מיד אחריו מגיעה הפעולה של מפל איתות מורכב שבו מסומנים נגעים, ואחריו תיאום התקדמות מחזור התא והפעלת מסלולי התיקון הנדרשים. בנוסף, נזק לדנ"א גורם לשינויים שונים, כגון אצטיל ומתיל אדוקטים, המאפשרים גיוס חלבונים23. המגוון הגדול של PTMs המעורבים בנגעי DNA מוביל לשאלה כיצד מנגנונים מולקולריים אלה מווסתים את הדו-קיום שלהם ומה החשיבות התפקודית של הגנה על שלמות הגנום באמצעות רשת משולבת מורכבת ביותר. לדוגמה, ליזין 9 טרימתילציה של היסטון H3 (H3K9me3) נקשרה לפתולוגיות שונות במחלות שונות24. מסיבות כגון זו, יש צורך לפתח מתודולוגיות אנליטיות אינסטרומנטליות המאפשרות אפיון מלא של שינויים אלה ברמה התאית23.

ניתוח של מיצויי היסטון HeLa S3 באמצעות תוכנה ידנית לניתוח נתונים ותוכנת ניתוח פרוטאומית גילה PTMs, כולל אצטילציה (+42.01 Da), מתיל-פרופיונילציה (+70.04 Da), דימתילציה (+28.03 Da) וטרימתילציה (+42.05) עבור מספר חלבוני היסטון. בנוסף, שיטת MS/MS מבוססת PASEF הצליחה להבדיל בין כמה פפטידים איזומריים מיקום הנושאים את אותם PTM.

במבוא, היתרונות של צימוד LC-TIMS-ToF MS/MS במחקר של PTMs כדי להראות את ההתפתחויות האחרונות של DDA באמצעות הצטברות מקבילית במלכודת הניידות ואחריה פיצול רציף ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות מתוארים בקצרה. הרעיון המרכזי הוא להקים מתודולוגיה המאפשרת רזולוציה של אותות המגיעים מפפטידים שונים וכי עד כה, טכניקות קלאסיות לא הצליחו לפתור. תהליך derivatization באמצעות אנהידריד propionic מונע את הפיצול של מסופי C ליזין על ידי טריפסין, יצירת פפטידים ארוכים יותר, אינפורמטיבי יותר. פפטידים עם אותו m/z וזמן שמירה היו מסוגלים להיות מזוהים על ידי דפוסי הפיצול שלהם, אך נראה גם שניתן היה להפריד חלק מהמינים הללו בתחום הניידות באמצעות שיטת LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS זו.

כדי להבין זאת טוב יותר, איור 8 מייצג שלושה מאפיינים עיקריים של כל מולקולה, מה שמאפשר זיהוי של תרכובת, בין אם הם חלבונים, שומנים או פפטידים שלמים (במקרה הזה, היסטון H3 18-26), אם לציין כמה דוגמאות. מאפיינים אלה כוללים את זמן השמירה (מינימום) של תרכובת בעמודה הכרומטוגרפית, יחס מטען המסה (m/z) של כל תרכובת, והניידות (1/Ko) שתרכובות אלה מציגות כאשר הן מתקשרות עם גז הסחף. באיור 8A, פפטיד H3 18-26 שלא שונה מוצג כבעל RT של 28.15 דקות וכי הוא מציג שני פסים בספקטרום הניידות שלו, מה שמצביע על כך שיש לו לפחות שתי קונפורמציות, תוצאה החשודה כתוצאה משני הליזין (18 ו-23) שעברו פרופיונילציה בעקבות הפרוטוקול שתואר קודם לכן. הספקטרום הבא (איור 8B,C) מראה את אותו פפטיד (H3, 18-26), אך משנה את המיקום של קבוצת האצטילציה (42.02) בין B, K18Ac ו-C, K23Ac. שני איזומרים אלה (K18Ac ו-K23Ac) זוהו באמצעות המובילוגרמה, כפי שהם מציגים התפלגות מרחבית שונה, מה שגורם לאינטראקציות שונות עם הגז בתא TIMS. חשיבותה של שיטה זו טמונה באפשרות לזהות ולחקור בפירוט רב יותר את ה- PTMs השונים שנקשרו למחלות שונות באמצעות, למשל, נזק ל- DNA.

כאשר נתוני הפיצול דלילים, זיהוי שינוי בשארית מסוימת הוא מאתגר מכיוון ששני שינויים שונים או יותר יכולים להתרחש בו זמנית באותן שאריות (או בקרבתן) וניתן להבין אותם כשינוי יחיד25. ניתן לפתור זאת על ידי הבטחת זיהוי הפפטיד שלא שונה, במיוחד על ידי שימוש בתקן כדי לאשר או להכחיש את נוכחותו של שינוי יחיד במקום שינויים מרובים (טבלה 1).

כדי למנוע זיהום מוגזם או מיצוי של היסטונים לא טהורים, חשוב לבדוק את איכות הריאגנטים לפני השימוש. לדוגמה, אם תמיסת החיץ NIB מאוחסנת ומשמשת בכמויות גדולות, ודא שהפתרון ברור ללא מראה חיצוני של עכירות או הצגה חריגה. עכירות עשויה להיות תוצאה של צמיחת חיידקים, אשר יזהמו דגימות ועלולה לגרום לתערובת של היסטונים וחלבונים חיידקיים. בנוסף, מומלץ להכין עקומות כיול חדשות למבחנים, כגון בדיקת BCA או Bradford המשמשת לקביעת ריכוז החלבון, כדי להבטיח שהחלבון המשמש לעקומת הכיול לא פג תוקף או מתפרק.

שיטה זו יכולה להיות מורחבת סוגים אחרים של תאים או אורגניזמים, למשל, יתושים. במקרה של אורגניזמים שלמים או חלקיים, בחירת מספר מתאים של אורגניזמים חשובה במיוחד כדי להבטיח שריכוז ההיסטון הסופי מתאים לניתוח.

כמו כן, כהנחיה כללית לתחזוקת ספקטרומטר מסה, יש לנקות את הקצה הקדמי מעת לעת כדי למנוע הצטברות על המכשיר וזיהום בין מסלולים. ניקוי זה צריך לכלול את הווילון, צלחת הפתח והקוואדרופול, לפי הצורך.

באופן כללי, כאשר LC משמש, יש צורך לקחת בחשבון הכנת שלב נייד טרי (ים) בכל שבוע באמצעות ממיסים כיתה MS. מומלץ לשמור פיפטות וכלי זכוכית ייעודיים להכנת פאזה ניידת ולטהר את קווי LC בכל פעם שפתרונות חדשים מונחים על המערכת. בדרך כלל יש להחליף עמודי שמירה והפרדה כל 100-200 זריקות ו-500-1500 זריקות בהתאמה26. הקפד להזריק חסר לפני ואחרי הפעלת אצווה של דגימות. אם יש מספר רב של דגימות בתוך אצווה נתונה, ניתן גם לשקול הפעלת ריק במרווחי זמן שונים בתוך האצווה.

הפרוטוקול מספק זרימת עבודה DDA מבוססת PASEF לזיהוי PTM היסטון והתמיינות של מינים איזובריים ואיזומריים בהתבסס על ניידות יונים.

פרוטוקול זה דורש הכנת דגימה נרחבת, ויש לקחת בחשבון את זמן הכנת הדגימה הניסויית הכוללת. בממוצע, פרוטוקול הכנת המדגם דורש 2-3 ימי עסקים כדי להשלים. בנוסף, הבדלים בין מעבדות וגרסאות מכשירים יכולים להשפיע על הרגישות הכוללת של הניתוח.

מעט מאוד תוכנות ניתוח נתונים פרוטאומיות נחשבו מתאימות לשימוש בניתוח היסטונים בשיטות מלמטה למעלה ללא התאמה ידנית או תיקון 27,28,29. התוצאות צריכות להיות מאושרות (לפחות בהתחלה) באמצעות ניתוח ידני, שגם הוא גוזל זמן. אם נעשה שימוש בתוכנה אנליטית, עליה להיות בעלת יכולות ביאור MS/MS, שבדרך כלל קל לאשר או לדחות.

ראוי גם להזכיר כי אי אפשר להפריד איזומרים באמצעות ספקטרומטריית מסות אלא אם כן מכניסים תא TIMS ומשתמשים בערכי ניידות; לדוגמה, ניתן לקבוע את מיקומם של שינויי היסטון באמצעות דפוסי פיצול (PASEF).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מלווין א. פארק ומתיו ווילטס הם עובדים של Bruker Daltonics Inc., יצרנית מכשיר timsTOF.

Acknowledgments

חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מס '. HRD-1547798 ומענק מס' HRD-2111661. מענקי NSF אלה הוענקו לאוניברסיטה הבינלאומית של פלורידה כחלק מתוכנית המרכז למצוינות במחקר במדע וטכנולוגיה (CREST). זוהי תרומה מספר 1672 מהמכון לסביבה, תוכנית בולטת באוניברסיטה הבינלאומית של פלורידה. תמיכה נוספת ניתנה על ידי המכון הלאומי לבריאות במסגרת מענק מס '. R21AI135469 לפרנסיסקו פרננדז-לימה וגרנט לא. R01HD106051 לבנג'מין א. גרסיה, כמו גם על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מס '. CHE-2127882 לבנג'מין א. גרסיה. המחברים רוצים להודות על התמיכה הראשונית של ד"ר מריו גומז הרננדז במהלך פיתוחי השיטה הראשוניים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 Animal Origin-Free
1 mL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060710 Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 14-282-300 Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060100 Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40 Thermo Fisher Scientific 28324 NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ (Mediatech) MT21031CM
15 mL Conical Tubes Corning 352196 Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 02-707-138 Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060310 Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610737 Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical Tubes Corning 352070 Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plate Thermo Fisher Scientific 12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μL Axygen P-DW-500-C-S
Acetone Sigma Aldrich 179124 ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN) Thermo Fisher Scientific A998 HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade Thermo Fisher Scientific LS120 Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSF Thermo Fisher Scientific 328110500 AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 Sigma Aldrich 09830 BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OH Sigma Aldrich AX1303 Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar) Airgas AR HP 300
BEH C18 HPLC column Waters 186003625 XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A7906 Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2 Sigma Aldrich C4901 Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation buffer Thermo Fisher Scientific 13151014
Ceramic scoring wafer Restek 20116
Compass DataAnalysis 6.0 Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2 Bruker Daltonics
Compass IsotopePattern Bruker Daltonics
Compass timsControl 4.1 Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 89237526
Disposable Cell Lifters Thermo Fisher Scientific  08100240 Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet Pestles Thermo Fisher Scientific 12-141-363 Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher Scientific P2325 1 M
Formic acid (FA) Sigma Aldrich 695076 ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD (Molex (Polymicro) TSP075375
Glacial Acetic Acid Thermo Fisher Scientific A38S Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur Pipettes Sigma Aldrich BR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph  Shimadzu Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HCl Sigma Aldrich 258148 ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å Thermo Fisher Scientific 60106-402
Hypersep cartridge Thermo Fisher Scientific 60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF Agilent G1969-85000 TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLC Thermo Fisher Scientific A454 Optima for HPLC, Fisher Chemical  
Microcentrifuge Tube Adapters GL Sciences 501021514
Microcystin Thermo Fisher Scientific 50-200-8727 Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm LEAP PAL Parts LAP.11190933
Nanodrop Thermo Fisher Scientific model: ND3300
Nitrogen (N2) Airgas NI UHP300
PEAKS Studio X+ Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, Instachek Micro Essential Lab JR-113 Model: Hydrion
Potassium chloride, KCl Sigma Aldrich P3911 ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection Cell Next Advance  model: PC77
Propionic Anhydride Sigma Aldrich 8.00608 For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) NuAire, model: Nuwind NU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g ESI Source Solutions r13.aq.0003
SDS-PAGE Gels Bio-Rad 4569035 Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrate Thermo Fisher Scientific A11079.06 98+%
Sodium chloride, NaCl Sigma Aldrich S9888 ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18 VWR 76333-134 Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor Savant model: SC210A
Sucrose Millipore 1.07651 suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4  Sigma Aldrich 339741 99.999%
TIMS-ToF Mass Spectrometer Bruker Daltonics model Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCA Sigma Aldrich T0699 6.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Aldrich 302031 Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa Nanomate Advion model: TR263
TrypsinProtease, MS Grade Thermo Fisher Scientific 90057
Tube rotator Thermo Fisher Scientific 88881001
Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific 88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade Thermo Fisher Scientific LS118 Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245 (2019).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
  4. Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
  5. Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
  6. Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
  7. Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
  8. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  9. Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
  10. Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
  11. Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
  12. Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
  13. Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
  14. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  15. Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
  16. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
  17. Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
  18. Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
  19. Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
  20. Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
  21. Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
  22. Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
  23. Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
  24. Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
  25. Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
  26. Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
  27. Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
  28. Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
  29. Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).

Tags

כימיה גיליון 203
בדיקת שינוי היסטון באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה בזמן טיסה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandez-Rojas, M., Fuller, C. N.,… More

Fernandez-Rojas, M., Fuller, C. N., Valadares Tose, L., Willetts, M., Park, M. A., Bhanu, N. V., Garcia, B. A., Fernandez-Lima, F. Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (203), e65589, doi:10.3791/65589 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter