Summary
Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir "aşağıdan yukarıya" analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.
Abstract
Histon proteinleri ökaryotlar arasında oldukça bol miktarda bulunur ve korunur ve posttranslasyonel modifikasyonlar (PTM'ler) olarak bilinen yapıların bir sonucu olarak gen düzenlemesinde büyük rol oynar. Dış veya genetik faktörlere göre her bir PTM'nin veya PTM modelinin konumunu ve doğasını belirlemek, bu bilginin DNA transkripsiyonu, replikasyonu veya onarımı gibi biyolojik tepkilerle istatistiksel olarak ilişkilendirilmesine izin verir. Bu çalışmada, biyolojik örneklerden histon PTM'lerinin tespiti için yüksek verimli bir analitik protokol açıklanmaktadır. Tamamlayıcı sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisinin (LC-TIMS-ToF MS/MS) kullanımı, biyolojik olarak en ilgili modifikasyonların tek bir analizde ayrılmasını ve PTM atanmasını sağlar. Açıklanan yaklaşım, hareketlilik tuzağında paralel birikim ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışma kullanarak bağımlı veri toplamadaki (DDA) son gelişmelerden yararlanır. Histon PTM'leri, tutma sürelerine, hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atanır.
Introduction
Ökaryotik hücrelerde DNA, kromatin olarak nükleozom adı verilen fonksiyonel birimler halinde paketlenir. Bu birimler dört çekirdek histondan oluşan bir oktamerden oluşur (her biri H2A, H2B, H3 ve H4'ten ikişer)1,2,3,4. Histonlar, gen regülasyonundan büyük ölçüde sorumlu olan ökaryotlarda en bol bulunan ve yüksek oranda korunan proteinler arasındadır5. Histon posttranslasyonel modifikasyonları (PTM'ler), kromatin dinamiğinin düzenlenmesinde büyük rol oynar ve DNA transkripsiyonu, replikasyonu ve onarımı gibi çeşitli biyolojik süreçlerin donatılmasında büyük rol oynar6. PTM'ler öncelikle DNA 3,7 ile temas halinde olan histonların N-terminal bölgelerinin erişilebilir yüzeyinde meydana gelir. Bununla birlikte, kuyruk ve çekirdek modifikasyonları kromatin yapısını etkiler, nükleozomlar arası etkileşimleri değiştirir ve spesifik proteinleri işe alır 3,8.
Sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS) tabanlı proteomik sırasındaki güncel bir zorluk, ilgilenilen analitlerin potansiyel birlikte elüsyonudur. Veriye bağlı analizler (DDA) söz konusu olduğunda, bu, MS/MS edinme işlemi sırasında birkaç öncü iyonun potansiyel kaybına dönüşür9. Uçuş süresi (ToF) cihazları çok yüksek frekanstaspektrum alır 9,10 (onlarca kHz'e kadar)11; bu, karmaşık bir numune (MS1) içindeki toplam öncü iyonları hızlı bir şekilde tarayabilmelerini sağlar, böylece optimum hassasiyet ve MS/MS dizileme oranları (100 Hz'e kadar)9 vaat eder ve onları biyolojik numune analizi için ideal hale getirir10. Bununla birlikte, bu yüksek tarama hızlarında mevcut olan hassasiyet, MS/MS hızı9 ile sınırlıdır. Bu sınırlamaları azaltmak için ortogonal dört kutuplu uçuş süresi (qToF) kütle spektrometresi ile birlikte tuzağa düşürülmüş iyon hareketlilik spektrometrisinin (TIMS) eklenmesi kullanıldı. TIMS'de, tüm öncü iyonlar art arda biriktirilir ve dört kutuplu9 ile tek öncü kütleleri seçmek yerine, hareketliliklerinin bir fonksiyonu olarak ayrıştırılır. Paralel birikim-seri parçalanma (PASEF), herhangi bir hassasiyet kaybı olmadan saniyede yüzlerce MS/MS olayına izin verir9.
Bu çalışmanın temel amacı, hareketlilik tuzağında paralel birikim ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) kullanarak DDA'nın son gelişmelerini göstermekti. Histon PTM'leri, tutma sürelerine (RT'ler), hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Histon örnekleri, Bhanu ve ark. (2020)12.
1. Numune hazırlama
- Kültürlenmiş hücrelerin toplanması
- Hücreler %80 birleştiğinde, tripan mavisi dışlamasını kullanarak canlı olduklarından emin olun.
NOT: Bu deneyler için bir HeLa S3 hücre hattı kullanıldı, ancak bu yöntem herhangi bir kültürlenmiş hücreye uygulanabilir. - Ortamı aspire edin, ardından her plakaya 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) uygulayın.
- Tüm kalıntı ortamları durulamak için plakaları döndürün, ardından PBS'yi aspire edin ve 5 mL 1x PBS uygulayın.
- Hücreleri tek kullanımlık bir hücre kaldırıcı ile kazıyarak plakadan nazikçe ayırın.
- Her hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyerek pelet haline getirin.
- PBS'yi hücre peletinden aspire edin.
- Histon ekstraksiyonuna devam edin.
NOT: Hemen işlenemiyorsa, hücre peletini sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun. Peletleri devam etmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
- Hücreler %80 birleştiğinde, tripan mavisi dışlamasını kullanarak canlı olduklarından emin olun.
- Histon ekstraksiyonu
- Her hücre peletinin hacmini tahmin edin ve menisküsü kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin.
- Tüm numuneler için yeterli nükleer izolasyon tamponu (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 ve 250 mM sükroz) hazırlayın. Alternatif olarak, zaman içinde çok sayıda numunenin işlenmesi gerekiyorsa, tamponu toplu olarak yapın ve 2-8 °C'de 6 aya kadar saklayın veya yalnızca her ekstraksiyon için gerekli miktarda çözdürerek süresiz olarak -15 °C ila -25 °C'de saklayın ve dondurun.
NOT: Depolama sırasında arabellek boş kalmalıdır. Tampon herhangi bir zamanda bulanık veya anormal bir görünüm alırsa, atın ve yeni tampon hazırlayın. - Yıkama tamponunun hücre peletlerinin hacminin 50 katını hazırlayın ve aşağıdaki gibi inhibitörler ekleyin (2 numune başına yaklaşık 10 mL yıkama tamponu).
- 10 mL yıkama tamponu hazırlamak için 10 mL NIB, 30 μL 200 mM 4- (2-aminoetil) benzensülfonil florür hidroklorür [AEBSF], 10 μL 1 M ditiyotreitol [DTT], 20 μL 5 μM mikrosistin, 20 μL 5 M sodyum bütirat.
- Lizis tamponunu hazırlamak için yıkama tamponunun 1/5'ini çıkarın (yıkama tamponundan 1/5 hacim, %0,3 NP-40 veya NP-40 alternatifi).
NOT: Bazı hücre tipleri için çok aşındırıcı olabileceğinden, NP-40 veya NP-40 alternatifi yerine Triton-X 100 kullanmayın. - Hücre peletini 5 sütun yıkama tamponunda süspanse ederek ve 800 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyerek iyice yıkayın. Bu adımı iki kez tamamlayın, süpernatanı yıkamalar arasında aspire edin ve atın.
- Hücre peletinin hacminin hala kalıcı bir işaretleyici ile işaretlendiğinden emin olun. 10 hacim lizis tamponunda yeniden süspanse edin.
- Her bir peleti yeniden süspanse etmek için pipetle iyice karıştırın, ardından buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
- 15 dakika sonra, 4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve atın.
NOT: Pelet, orijinal pelet boyutunun ≤ 1/2'sine kadar küçülmelidir (işaret çizgisiyle gösterildiği gibi). Pelet yeterince azalmadıysa, parçalama prosedürünü tekrarlayın ve hücreleri kırmak için bir havaneli kullanarak hafif bir homojenizasyon adımı ekleyin. - Lizis tamamlandıktan sonra, peleti 500 μL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin, ardından 4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve atın, ardından tüm NP-40 izlerini gidermek için yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
NOT: Bu noktada pelet, histonlar içeren kromatinden oluşur. - Pelet, 0.4 N H2S04'lük 5 hacimde (orijinal hücre pelet boyutunda) yeniden süspanse edin.
- Bir karıştırıcı kullanarak soğuk bir odada veya buzdolabında 2 saat inkübe edin.
- 2 saat sonra, numuneyi/numuneleri 3400 x g'da 5 °C'de 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atmayın.
- Süpernatanı yeni tüplere aktarın ve% 100 trikloroasetik asidi (TCA) içeriğin hacminin 1 / 3'üne yükseltin (nihai TCA konsantrasyonu yaklaşık% 20 olacaktır).
- Tüpü yavaşça ters çevirin ve berrak, renksiz çözeltinin beyaza ve/veya bulanıklaştığını gözlemleyin, bu da protein çökelmesini gösterir.
NOT: Düşük histon konsantrasyonlarına sahip çözeltiler için, protein çökelmesi hemen fark edilmeyebilir, ancak çökelti, gece boyunca inkübasyondan sonra görünür olmalıdır. - Histon proteinlerini tamamen çökeltmek için gece boyunca (12-18 saat) 4 ° C'de rahatsız edilmeden inkübe edin.
- Ertesi gün, 4 °C'de 5 dakika boyunca 3400 x g'da santrifüjleyin.
- Pipet ucuyla tüpün kenarlarına dokunmamaya dikkat ederek süpernatanı aspire edin. Bu aşamada, histonlar öncelikle tüp(ler)in kenarlarında bir film olarak biriktirilir.
- Bir cam Pasteur pipeti kullanarak her tüpe 500 μL buz gibi soğuk aseton + %0,1 HCl (asit aseton) ekleyin, ardından tüp(ler)i birkaç kez hafifçe ters çevirin. Bunu yaparken numuneleri sırayla (1, 2, 3 vb.) düzenleyin, çünkü herhangi bir hatalı aseton tüpler üzerindeki işaretleri kaldırabilir. 3400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı nazikçe boşaltın.
- Bu durulama adımını 500 μL buz gibi %100 asetonla ve ayrıca bir cam Pasteur pipetiyle tekrarlayın. 3400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı nazikçe boşaltın.
- Kalan aseton buharlaşana kadar tüpleri oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
- Kuruduğunda, her tüpe 100 μL kütle spektrometresi (MS) sınıfı su ekleyin. Tüm histon filmini yeniden süspanse etmek için kabın her tarafını temizlemek için bu damlacığı kullanın. Bunu, damlacığı tüpün yan tarafına pipetleyerek ve yukarı ve aşağı pipetlerken döndürerek veya 100 μL'nin yarısını dağıtarak ve ucu kullanarak her tarafını karıştırarak yapın. Her iki yöntemin bir kombinasyonu en iyi sonucu verir. Histonlar suda kolayca çözünür ve çözelti içinde olacaktır.
- Tüm numuneleri yeniden askıya aldıktan sonra, kalan beyaz katı varsa, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir banyoda sonikat yapın.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Berrak çözeltiyi taze tüplere aktarın. Kalan çözünmeyen peletleri atın.
- Ekstraksiyonun temiz olduğunu doğrulamak için azaltma koşulları altında bir SDS-PAGE çalıştırın.
NOT: Jeller, proteinleri 10-20 kDa aralığında farklılaştırabildiği sürece herhangi bir uygun poliakrilamid konsantrasyonu kullanılarak çalıştırılabilir. Bu protokolde kullanılan jeller için Malzeme Tablosuna bakın. - Toplam protein konsantrasyonunu belirlemek için bir protein konsantrasyonu testi (yani Bradford veya BCA) gerçekleştirin.
- Lizin kalıntılarının kimyasal türevlendirilmesi (propiyonilasyon)
- 20 μg histonu (protein tahlili ile belirlenir) temiz bir tüpe aktarın. Bu numuneyi bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak <5 μL'ye kadar kurutun, ardından 20 μL 100 mM amonyum bikarbonat (NH4CO3) (~1μg/μL çözelti) kullanarak yeniden süspanse edin. Gerekirse amonyum hidroksit kullanarak pH'ı ~8'e ayarlayın.
DİKKAT: Yeniden süspanse etmek için amonyum hidroksit (NH4OH) kullanmayın, sadece gerekirse pH'ı ayarlamak için. Aksi takdirde, proteinler denatüre olur ve çökelir.
NOT: pH'ı minimum numune kaybıyla kontrol etmek için bir pipet ucu kullanarak numuneyi daldırın ve bir pH şeridine sürün. Bu test prosedürü, kalan numune hazırlama adımları boyunca faydalı olacaktır. - Asetonitril'e (ACN) 1:3 (h/v) oranında propiyonik anhidrit ekleyerek propiyonilasyon reaktifini hazırlayın (yani, 40 μL reaktif yapmak için 10 μL propiyonik anhidrit ile 30 μL ACN'yi birleştirin).
NOT: Geleneksel olarak, bir propiyonilasyon reaktifinin hazırlanmasında metanol veya izopropanol kullanılmıştır. Propiyonilasyon bir amid oluşum reaksiyonu olduğundan, metanol kullanımından kaynaklanan metil propiyonil ester gibi istenmeyen yan ürünleri ve reaksiyonları önlemek için asetonitril gibi protonik olmayan bir çözücü gereklidir. Reaktifin taze kalması için bir seferde sadece 4 numuneye kadar yeterli propiyonilasyon reaktifi hazırlayın. Reaktifi hazırlandıktan sonra 1-2 dakika içinde kullanın. Reaktif oturduğunda, propiyonik anhidrit herhangi bir ortam nemi ile reaksiyona girecek ve asetik asit oluşmaya başlayacak, bu da reaktifin etkinliğini değiştirebilecek ve reaktif eklendikten sonra histon çözeltisinin pH'ını değiştirecektir. - Her numuneye 1:4 (h/v) propiyonilasyon reaktifi ekleyin (yani, 20 μL histon için 5 μL propiyonilasyon reaktifi ekleyin).
- Çözeltinin pH'ını ~8'e yeniden ayarlamak için hızlı bir şekilde 1:5 (h/h)NH4OHekleyin (yani, 20 μL histon çözeltisi için 4 μL ekleyin). PH hala çok düşükse, pH 8'e ulaşılana kadar bir seferde 1-2 μLNH4OHekleyin. Tipik olarak, 1:5 (v/v) oranı yeterlidir.
- Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca rahatsız etmeden inkübe edin.
- Minimum asit oluşumunu sağlamak için propiyonilasyon reaksiyonunu, propiyonilasyon reaktifi partisi başına en fazla 3-4 numune için tekrarlayın.
- Propiyonilasyon prosedürü 1.3.2-1.3.5 adımlarını tekrarlayın. İkinci bir propiyonilasyon turu, mevcut lizinlerin% >95'inin türetilmesini sağlar.
- Numuneleri bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak <5 μL'ye kadar kurutun. Bu,NH4OH'densalınan reaksiyona girmemiş propiyonilasyon reaktifini, asit ürünlerini ve amonyak gazını buharlaştıracaktır. Numuneler tamamen kurursa, önemli numune kayıpları meydana gelmediğinden bu sorun olmaz.
NOT: Şişede kalan ortam nemi ile temas nedeniyle asetik asit oluşumunu önlemek için saklamadan önce propiyonik anhidrit şişesindeki havayı argon gazı ile değiştirin.
- 20 μg histonu (protein tahlili ile belirlenir) temiz bir tüpe aktarın. Bu numuneyi bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak <5 μL'ye kadar kurutun, ardından 20 μL 100 mM amonyum bikarbonat (NH4CO3) (~1μg/μL çözelti) kullanarak yeniden süspanse edin. Gerekirse amonyum hidroksit kullanarak pH'ı ~8'e ayarlayın.
- Tripsin ile proteolitik sindirim
- 20 μL'lik bir hacim elde etmek için histonları100 mM NH4HCO3'te yeniden süspanse edin ve 1 μg/μL'lik optimal bir konsantrasyon elde edin.
NOT: 1 μg/μL'den düşük konsantrasyonlara sahip numune çözeltileri, Tripsin verimliliğinin düşmesine neden olacaktır. - Histon örneklerine 1:10 oranında (ağırlıkça/ağırlıkça) tripsin ekleyin (yani, 20 μg histona 2 μL 1 μg/μL tripsin çözeltisi ekleyin).
- Reaksiyonları 37 °C'de 6-8 saat inkübe edin. Alternatif olarak, gece boyunca (12-18 saat) oda sıcaklığında inkübe edin.
- -80 °C'de en az 1 saat dondurarak sindirimi durdurun.
NOT: Sindirim reaksiyonunu söndürmek için asit kullanmayın, çünkü bu, prosedürün bu noktasında pH'da istenmeyen bir düşüşe neden olur. Numune, ilerlemeye hazır olana kadar -80 °C'de saklanabilir (Ara durma noktası).
- 20 μL'lik bir hacim elde etmek için histonları100 mM NH4HCO3'te yeniden süspanse edin ve 1 μg/μL'lik optimal bir konsantrasyon elde edin.
- Peptit N-terminallerinin kimyasal türevlendirilmesi (propiyonilasyonu)
- Numuneleri bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak <5 μL'ye kadar kurutun.
- 100 mM NH4HCO3 kullanarak 20 μL'ye (1 μg/μL) kadar numuneleri yeniden süspanse edin.
- Propiyonilasyonu daha önce olduğu gibi tekrarlayın (adım 1.3).
NOT: Daha yüksek sulu: organik faz oranı nedeniyle numunelerin bu adımda kurumasının daha uzun sürmesi normaldir.
- Aşama ipuçları ile numune tuzdan arındırma
- Numuneleri 50 μL MS sınıfı su +% 0.1 TFA ile yeniden süspanse edin veya seyreltin.
- 11-G'lik bir numune çekirdeği kullanarak, katı faz ekstraksiyon diskinden 5 disk C18 malzemesini delin (pipet ucuna aktarmadan önce 5 diski de delin). Disklerin 200 μL'lik bir pipet ucunun altına güvenli ve eşit bir şekilde sıkıştığından emin olun (Şekil 1).
NOT: 15 μg'dan fazla tuzdan arındırıyorsanız 25 G çekirdek kullanın.amptek bir s'den s.tage uç. - Sahne uçlarını 1.5 mL veya 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde yerinde tutmak için bir santrifüj adaptörü kullanın.
NOT: Aşağıdaki santrifüj adımları için, bir seferde 4-2 dakika boyunca 4 °C'de yavaş (400-500 x g) devir kullanın; çözücüler, C18 malzemesinin uçlara ne kadar sıkı paketlendiğine bağlı olarak normalde reçineden 1 dakikadan daha kısa sürede geçer. - C 18 malzemesini aktive etmek ve potansiyel kirleticileri gidermek için reçineyi 50 μL %100 asetonitril ile santrifüjleyerek durulayın.
NOT: Jel yüklemeli pipet uçlarını kullanarak çözeltileri sahne uçlarına yüklemek daha kolay olabilir. C18 malzemesi etkinleştirildikten sonra, tuz giderme prosedürü süresince reçinenin kurumasına izin verilmemesi önemlidir. - Disk malzemesini santrifüjleme ile 80 μL MS sınıfı su +% 0.1 TFA ile dengeleyin.
- Buzlu asetik asit kullanarak numuneyi pH 4 veya daha düşük bir değere asitleştirin. Örnek kaybını en aza indirmek için pH'ı daha önce olduğu gibi pH şeritleriyle kontrol edin.
- Yavaş santrifüjleme ile numunenin tamamını reçine diskine yükleyin.
- Numuneyi santrifüjleme ile 80 μL MS sınıfı su +% 0.1 TFA ile yıkayın.
- Yavaş santrifüjleme ile 70 μL %75 asetonitril ve %0,5 asetik asit yıkayarak numuneyi 1,5 mL'lik temiz bir tüpe boşaltın. Tam numune hacminin aşama ucundan ayrılmasını sağlamak için ek santrifüj süresi kullanılabilir. Reçinenin ek santrifüj süresi ile kuruması sorun değildir, çünkü numunenin elüsyonundan sonra artık gerekli değildir.
- Her numuneyi bir vakum yoğunlaştırıcıda tamamen kurutun.
NOT: Numune(ler) devam etmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklanabilir (Ara durma noktası). - LC-MS/MS analizi için, numuneleri 0,4 μg/μL'lik nihai konsantrasyonu veren sıvı kromatografi (LC) protokolünden bir Çözücü A hacminde (%0,1 formik asit) sulandırın (yani, 20 μG histonu 50 μL Çözücü A'da çözün).
2. TIMS yazılım arayüzü
- Cihaz sekmesini seçin ve Çalıştır'a geçin (cihaz adının yeşil renkle vurgulandığını doğrulayın) (Şekil 2).
- TIMS parametrelerini doğrulayın (Şekil 2).
- MS Ayarlarını doğrulayın (tarama başlangıcı, tarama sonu, iyon polaritesi, tarama modu) (Şekil 2).
- TIMS ayarlarını doğrulayın (mod, mobilite başlangıcı, mobilite sonu, ramp süresi, biriktirme süresi, görev döngüsü, rampa hızı, MS hızı, MS ortalaması ve otomatik kalibrasyon) (Şekil 2).
- Kaynak sekmesine gidin ve şırınga seçeneğini etkinleştirin (Hamilton 500 μL) yalnızca TuneMix kalibrasyon adımı için (Şekil 3)13.
- Kalibrasyon sekmesine gidin, m/z'ye tıklayın, Kalibrasyon Modu'nu seçin ve modu seçin (Genel olarak Gelişmiş Q), yakınlaştırın (+%0.01) STD Dev (0.24) ve Kalibre Et'e tıklayın; %100'lük bir puan elde edildiğinde kabul edin (Şekil 4).
- Mobilite sekmesine gidin ve kalibrasyon işlemini tekrarlayın (genellikle Doğrusal Mod), algılama aralığı (+%5), genişlik (0.1 Da), STD Dev (0.1855), ardından kalibre et'e tıklayın; %98,5≥ bir puan aldığınızda kabul edin (Şekil 5).
- Yönteme gidin ve kullanılacak yöntemi seçin; bu örnek için Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl seçilmiştir (Şekil 5).
3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS
- Tipik nESI çalışma koşullarını kullanın: 4500 V kapiler gerilim, 800 V uç plakası ofseti, 3,0 bar nebulizatör basıncı, 10,0 L/dk kuru gaz, 200 °C kuru ısıtıcı ve 50 μL/dk enjeksiyon debisi.
- Tipik MS ayarlarını kullanın: 6 eV çarpışma enerjisi, 1200 Vpp çarpışma RF, 75 μs aktarım süresi, 5 μs ön darbe depolama.
- Giriş hunisi P1 ve çıkış hunisi P2 arasındaki basınç farkını kullanarak sürüklenen gaz akışını belirleyin. TIMS hücresinde paralel birikim-seri parçalanma (PASEF) meydana gelir ve tüm öncü iyonları ayrı ayrı değil, aynı anda biriktirir. Öncü iyonlar daha sonra normalde çok daha geniş olan piklere (yaklaşık 50 kat daha kısa) karşı dar iyon piklerinde salınır, bu da hareketlilik14 yoluyla birlikte elüsyonlu peptitleri ayırırken sinyal-gürültü oranını arttırır.
- Proteolitik histon peptitlerini analiz etmek için bir LC-TIMS-ToF MS/MS yöntemi geliştirin. C18 (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) sütunla donatılmış yüksek performanslı bir sıvı kromatografını (HPLC) tescilli PASEF teknolojisine sahip ticari bir TIMS-TOF MS cihazıyla birleştirin.
NOT: Bu sütun boyutunun, daha önce yayınlanmış çalışmalara15,16,17 dayalı olarak, peptit karışımları için hem yüksek hem de düşük pH'ta iyi bir ayırma sağladığı belirlenmiştir.- Enjeksiyon hacmini 20 μL (8 μg) numune ve 0,4 mL/dk akış hızına ayarlayın.
- %0,1 formik asit (Çözücü A) içeren su ve %0,1 formik asit (Çözücü B) içeren asetonitril kullanarak 60 dakikalık, doğrusal olmayan bir LC gradyanı çalıştırın. Gradyanı ayarlayın: 2,7 dakika boyunca %10 B, ardından 5,3 dakika içinde %20 B, 4 dakika içinde %28 B, 18 dakika içinde %35 B, 13 dakika içinde %40 B ve 2 dakika sonra %100 B. %100 B'yi 5 dakika basılı tuttuktan sonra, konsantrasyonu 5 dakika içinde %10 B'ye düşürün ve son 5 dakika basılı tutun.
- Pozitif iyonizasyon modunda nano-elektrosprey iyonizasyon (nESI) yoluyla HPLC'den TIMS-TOF'a numune elüsyonunu doğrulayın.
4. Veri analizi
- Peptit dizilerini ve modifikasyon bölgelerini tanımlayın.
- MS-digest aracı altında ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] kullanarak teorik bir peptit listesi hazırlayın.
- Sindirimin koşullarını (kullanılan enzim), aranan PTM türlerini (örneğin, mono-, di- veya trimetilasyon), aranan peptitlerin boyut aralığını, kütle algılama aralığını ve kaçırılan bölünmelerin potansiyel sayısını göz önünde bulundurarak teorik bir özet gerçekleştirin.
- MS-digest aracı altında ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] kullanarak teorik bir peptit listesi hazırlayın.
- Elde edilen verileri teorik peptitlere dayalı olarak manuel olarak analiz edin (Şekil 6)12.
- Her teorik peptit için çeşitli şarj durumlarında (+1 ila +4) kütleler aranır.
- Her m/z'nin ilk tanımlamasını takiben, tepe noktasını seçin ve PTM'ler de dahil olmak üzere peptit dizisine dayalı teorik bir parçalanma iyonları listesi kullanarak MS/MS'yi onaylayın.
NOT: Tanımlanan peptidin hareketliliği daha önce biliniyorsa, bu da doğrulanır.
- Çeşitli PTM'lerin nispi bolluklarını hesaplayın ve her bir modifikasyonu belirtilen peptit dizisinin bir yüzdesi olarak rapor edin.
- Tespit edilen her PTM'nin nispi bolluğu aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanır:
Bağıl bolluk = Belirli bir peptit için PTM Alanı / Değiştirilmemiş ve PTM'lerin toplam alanı
- Tespit edilen her PTM'nin nispi bolluğu aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanır:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aşağıdan yukarıya bir proteomik iş akışı (Şekil 7) tipik olarak aşağıdakileri içerir: ham bir numuneden hedef protein(ler)in ekstraksiyonu, ardından protein(ler)in konsantrasyonunun ölçülmesi ve ardından genellikle jel elektroforezi veya sıvı kromatografisi ile fraksiyonlama. Fraksiyonlamadan sonra, proteinler bir proteolitik enzim (genellikle tripsin) kullanılarak sindirilir ve son olarak, elde edilen peptitlerin kütle spektrometrik analizi ve yerleşik bir veri tabanı18 kullanılarak protein tanımlaması yapılır. Dizi bilgisi, belirtilen kütle-yük (m/z) aralığındaki öncü iyonlardan türetilir ve bunlar çarpışma kaynaklı ayrışmaya (CID) tabi tutulur ve bir veri tabanı19 kullanılarak tanımlanacak ve dizilenecek parçalanma modelleri üretir (Şekil 8).
Bu çalışma için temel amaç, protokol bölümünde daha önce açıklanan adımları izleyerek bir LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA yöntemi geliştirmek ve uygulamaktı. İzomerik ve izobarik peptitler üzerindeki posttranslasyonel modifikasyonların konumsallığının belirlenmesi, tanımlama ve spektrum yorumlama ile ilgili özel bir zorluk ortaya çıkarmıştır. Bu çalışmada rekombinant insan histon standartları ve HeLa S3 hücreleri örnek olarak kullanılmıştır.
ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS aracılığıyla insan histon standartlarının histon PTM analizi, peptit başına 5 yüke kadar tespit edilen orta ila büyük boyutlu peptitler (3-30 amino asit uzunluğunda) verdi. Propiyonilasyon prosedürü, Triptik sindirim tarafından yaygın olarak üretilenlerden daha uzun, daha bilgilendirici peptitlerin üretilmesinde başarılı oldu. Veri analizi üzerine, peptitler çeşitli modifiye edilmiş durumlarda tanımlandı. Bir avantaj olarak, TIMS tabanlı yöntem, aynı PTM'leri taşıyan bazı konumsal izomerik peptitleri farklılaştırdı. Örneğin, iki izomerik tür, alıkonma süresi ve m/z bakımından üst üste gelebilir; bununla birlikte, iki sinyal hareketlilik alanında ayrılabilir (Şekil 9).
Şekil 9'da gösterilen peptitler için karşılık gelen parçalanma spektrumları, uygun FASTA dosyaları kullanılarak proteomik analiz yazılımı tarafından açıklandı. Şekil 9A'da, modifiye edilmemiş peptit, üç propiyonil (+56.03) grubu (N-terminali, lizin 18 ve lizin 23 üzerinde) ile görülmektedir. Şekil 9B'de peptit, lizin 18 üzerinde bir asetil grubu (+42.02) ve iki propiyonil grubu (biri N-terminalinde ve diğeri lizin 23'te) ile gözlenir. Son olarak, Şekil 9C'de peptit, lizin 23 ve iki propiyonil grubu (N-terminali ve lizin 18 üzerinde) üzerinde gözlenen bir asetilasyon ile görülmektedir. Daha önce yayınlandığı gibi, PASEF avantajı, aynı özelliği tekrar tekrar hedefleyerek dizileme hızını ve hassasiyetini artırmak için kullanılabilir9. Bu, kullanıcının biyolojik örneklerden daha fazla yapısal bilgi elde etmesini sağlar. Bu durumda, bu, her histonda meydana gelen PTM'lerin tipine ve konumuna uygulanır.
Posttranslasyonel modifikasyon analizi, Şekil 10'da görüldüğü gibi, görsel olarak bir dizi kapsama grafiği olarak da temsil edilebilir. Şekil 10A'da, sindirimden önce propiyonile edilmiş olan histon H3 standardı, mavi çizgilerle gösterilen, aksi takdirde ortaya çıkacak olandan daha uzun peptitler sunar. HeLa S3 hücrelerinden ekstrakte edilen histonlar, Şekil 10B'de gösterildiği gibi aynı şekilde işlendi. Aynı amino asit pozisyonlarında birçok farklı model dahil olmak üzere birkaç PTM belirtildi. Biyolojik örneklerden bu beklenir. Dikkat çekici bir şekilde, Şekil 10B'deki birkaç gri çizgi, düşük yoğunluktan kaynaklanan bir MS2 eksikliğinden dolayı belirsiz bir şekilde tanımlanan peptitleri gösterir.
Şekil 1: Aşama uçlarının şematik gösterimi ve üretimi. (A-G) C18-silika disk tabla ucunun üretimi hakkında adım adım kılavuz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Veri işleme: 20210804 Propiyonillenmiş Standart Histonlar Mix_QC Peptit. Verileri işlemeye başlamadan önce, bu değerleri temel tepe kromatogramından (BPC + All MS) çıkarmak için olası yük durumlarının ve parçalanmalarının (1550.9013; 775.9543; 517.6386; vb.) teorik listesini hazırladığınızdan emin olun. Her peptidi çıkardıktan sonra, şekilde gösterilen analiz listesine benzediğinden emin olun. Zirve 775.9543 örnek olarak seçildi. Şeklin sağ tarafında üç grafik gösterilmektedir: birincisi kromatograma (yoğunluk ve zaman grafiği), ikincisi mobilograma ve üçüncüsü PASEF parçalanması dahil kütle spektrumuna karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: timsControl protokolünün 1-4 arası adımları. Şekil, timsControl prosedürünün ilk dört adımını göstermektedir. Enstrüman ile yazılım arasındaki bağlantıyı açmak ve kapatmak için sol üst taraftaki Enstrüman düğmesine tıklayın. Herhangi bir görevi yerine getirmeden önce, yazılımın çalışma modunda olduğundan emin olunmalıdır. Son olarak, TIMS parametrelerinin doğru olduğundan emin olun. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kaynak parametreleri. Bu durumda, Şırınga Hamilton 500 μL yalnızca TuneMix için kullanıldı. Diğer parametrelerin doğru kaldığını doğrulayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kütle-şarj (m/z) kalibrasyonu. Sol alt panelde %100 puan elde edilene kadar Kalibre Et'i seçin Kalibrasyon Modu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Mobilite kalibrasyonu. Sol alt panel Kalibrasyon Modunda en az %98,5'lik bir puan elde edilene kadar Kalibre Et'i seçin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Tipik aşağıdan yukarıya proteomik iş akışı. Numune hazırlamadan tanımlamaya kadar aşağıdan yukarıya prosedürlerin adım adım tanıtımı9. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Alıkonma süresi, izotopik model ve H3 18-26 hareketlilik profilleri. (A) Modifiye edilmemiş propiyonillenmiş, (B) diğer iki pozisyonda propiyonile edilmiş K23Ac peptit ve (C) diğer iki pozisyonda K18Ac propiyonillenmiştir. B ve C panellerinde gösterilen yapısal izomerler için hareketlilik ayrımının avantajlarına dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: PASEF kullanılarak MS/MS parçalanma peptit dizilimi örneği. Fragman spektrumları, amino asit pozisyonları 18-26 olan H3 peptidi için proteomik analiz yazılımından elde edildi. (A) modifiye edilmemiş propiyonillenmiş, (B) diğer iki pozisyonda propiyonile edilmiş K23Ac peptit ve (C) diğer iki pozisyonda K18Ac propiyonillenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Görsel histon PTM analizi özeti örneği. HeLa S3 hücrelerinden (A) bir H3 standardından ve (B) H3'ten gözlemlenen peptitlerin ve PTM'lerin sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Standart ve HeLa S3 peptid LC-TIMS-ToF MS/MS özellikleri. Deneysel özellikler (yani, alıkonma süresi, m/z, 1/Ko ve LC tepe alanları) dahil olmak üzere hedef ve gözlemlenen peptit listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histonlar, dört çekirdek histondan (H2A, H2B, H3 ve H4'ün ikişer tane) oluşan oktamerler şeklinde DNA ile etkileşime girerek kromatin yapısını düzenleyen temel proteinlerdir.20. Histonlar, kolayca değiştirilebilen çok sayıda lizin ve arginin kalıntısı içerir, bu da histon fonksiyonunu etkileyerek veya diğer hücresel proteinlere bağlanarak kromatin kimyasını değiştiren kapsamlı PTM'lere yol açar21. PTM'ler, çeşitli hastalıklarda, özellikle de çeşitli kanser türlerinde bildirilen belirli PTM grupları ile birlikte çalışarak biyolojik yanıtlar ortaya çıkarabilir22.
DNA hasarı hücresel düzeyde fark edildiğinde, bunu hemen lezyonların işaretlendiği karmaşık bir sinyal kaskadının etkisi, ardından hücre döngüsü ilerlemesinin koordinasyonu ve gerekli onarım yollarının aktivasyonu takip eder. Ek olarak, DNA hasarı, protein alımını kolaylaştıran asetil ve metil eklentileri gibi çeşitli modifikasyonları indükler23. DNA lezyonlarında yer alan çok çeşitli PTM'ler, bu moleküler mekanizmaların bir arada bulunmalarını nasıl düzenlediği ve genomun bütünlüğünü son derece karmaşık bir entegre ağ aracılığıyla savunmanın işlevsel öneminin ne olduğu sorusuna yol açar. Örneğin, histon H3'ün (H3K9me3) lizin 9 trimetilasyonu, çeşitli hastalıklarda farklı patolojilerle ilişkilendirilmiştir24. Bu gibi nedenlerden dolayı, bu modifikasyonların hücresel düzeyde tam karakterizasyonuna izin veren araçsal analitik metodolojilerin geliştirilmesi gerekmektedir23.
Manuel veri analiz yazılımı ve proteomik analiz yazılımı kullanılarak HeLa S3 histon ekstraksiyonlarının analizi, asetilasyon (+42.01 Da), metil-propiyonilasyon (+70.04 Da), dimetilasyon (+28.03 Da) ve trimetilasyon (+42.05) dahil olmak üzere PTM'leri ortaya çıkardı. Ek olarak, PASEF tabanlı MS/MS yöntemi, aynı PTM'leri taşıyan bazı konumsal izomerik peptitleri ayırt edebildi.
Giriş bölümünde, hareketlilik tuzağında paralel birikim ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışma kullanılarak DDA'nın son gelişmelerini göstermek için PTM'lerin çalışmasında LC-TIMS-ToF MS/MS'nin birleştirilmesinin avantajları kısaca anlatılmaktadır. Ana fikir, farklı peptitlerden gelen sinyallerin çözülmesine izin veren ve şimdiye kadar klasik tekniklerin çözemediği bir metodoloji oluşturmaktır. Propiyonik anhidrit kullanılarak yapılan türevlendirme işlemi, lizin C-terminallerinin Tripsin tarafından bölünmesini önleyerek daha uzun, daha bilgilendirici peptitler üretir. Aynı m/z ve alıkonma süresine sahip peptitler, parçalanma modelleriyle tanımlanabildi, ancak bu türlerin bazılarının bu LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS yöntemi kullanılarak hareketlilik alanında ayrılabildiği de görüldü.
Bunu daha iyi anlamak için, Şekil 8 , herhangi bir molekülün üç ana özelliğini temsil eder, böylece bozulmamış proteinler, lipitler veya peptitler (bu durumda, histon H3 18-26) olsun, bir bileşiğin tanımlanmasına izin verir. Bu özellikler, bir bileşiğin kromatografik kolonda tutma süresini (min), her bir bileşiğin kütle-yük oranını (m/z) ve bu bileşiklerin sürüklenme gazı ile etkileşime girdiklerinde sundukları hareketliliği (1/Ko) içerir. Şekil 8A'da, modifiye edilmemiş H3 peptidi 18-26'nın 28.15 dakikalık bir RT'ye sahip olduğu ve hareketlilik spektrumunda iki bant sunduğu, en az iki konformasyona sahip olduğunu gösteren bir sonuç olduğu gösterilmiştir. Aşağıdaki spektrumlar (Şekil 8B, C) aynı peptidi (H3 18-26) gösterir, ancak asetilasyon grubunun (42.02) B, K18Ac ve C, K23Ac arasındaki konumunu değiştirir. Bu iki izomer (K18Ac ve K23Ac), TIMS hücresindeki gazla farklı etkileşimlere neden olan farklı uzamsal dağılımlarla ortaya çıktıkları için mobilogram aracılığıyla tanımlanmıştır. Bu yöntemin önemi, örneğin DNA hasarı yoluyla farklı hastalıklarla ilişkilendirilen farklı PTM'leri daha ayrıntılı olarak tanımlama ve inceleme olasılığında yatmaktadır.
Parçalanma verileri seyrek olduğunda, belirli bir kalıntıdaki bir modifikasyonu tanımlamak zordur, çünkü aynı kalıntılarda (veya yakınında) iki veya daha fazla farklı modifikasyon aynı anda meydana gelebilir ve tek bir modifikasyon olarak anlaşılabilir25. Bu, modifiye edilmemiş peptidin, özellikle çoklu modifikasyonlar yerine tek bir modifikasyonun varlığını doğrulamak veya reddetmek için bir standart kullanılarak tanımlanmasını sağlayarak çözülebilir (Tablo 1).
Saf olmayan histonların aşırı kirlenmesini veya ekstraksiyonunu önlemek için, kullanmadan önce reaktiflerin kalitesini kontrol etmek önemlidir. Örneğin, NIB tampon çözeltisi toplu olarak depolanıyor ve kullanılıyorsa, çözeltinin berrak olduğundan ve bulanıklık veya anormal bir sunum olmadığından emin olun. Bulanıklık, numuneleri kontamine edecek ve histonlar ve bakteriyel proteinlerin bir karışımıyla sonuçlanabilecek bakteri üremesinin bir sonucu olabilir. Ek olarak, protein konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan BCA veya Bradford testi gibi tahliller için yeni kalibrasyon eğrilerinin hazırlanması tavsiye edilir, bu da kalibrasyon eğrisi için kullanılan proteinin son kullanma tarihinin geçmemesini veya bozulmamasını sağlar.
Bu yöntem, sivrisinekler gibi diğer hücre veya organizma türlerine genişletilebilir. Tam veya kısmi organizmalar söz konusu olduğunda, nihai histon konsantrasyonunun analiz için uygun olmasını sağlamak için uygun sayıda organizmanın seçilmesi özellikle önemlidir.
Ayrıca, kütle spektrometresi bakımı için genel bir kılavuz olarak, cihaz üzerinde birikmeyi ve çalışmalar arasında kontaminasyonu önlemek için ön uç periyodik olarak temizlenmelidir. Bu temizlik, gerektiğinde perdeyi, orifis plakasını ve dört direği içermelidir.
Genel olarak, bir LC kullanıldığında, MS sınıfı çözücüler kullanarak her hafta taze mobil faz(lar) hazırlamayı dikkate almak gerekir. Mobil faz hazırlığı için özel pipetler ve cam eşyalar bulundurmak ve sisteme yeni çözümler yerleştirildiğinde LC hatlarını temizlemek iyi bir uygulamadır. Koruma ve ayırma kolonları genellikle sırasıyla her 100-200 enjeksiyonda ve 500-1500 enjeksiyonda bir değiştirilmelidir26. Bir grup numuneyi çalıştırmadan önce ve sonra boşlukları enjekte ettiğinizden emin olun. Belirli bir parti içinde çok sayıda numune varsa, parti içinde çeşitli aralıklarla bir boşluk çalıştırmayı da düşünebilirsiniz.
Protokol, histon PTM'lerini tespit etmek ve iyon hareketliliğine dayalı olarak izobarik ve izomerik türlerin farklılaşması için PASEF tabanlı bir DDA iş akışı sağlar.
Bu protokol kapsamlı numune hazırlığı gerektirir ve genel deneysel numune hazırlama süresi hesaba katılmalıdır. Ortalama olarak, numune hazırlama protokolünün tamamlanması 2-3 iş günü sürer. Ek olarak, laboratuvarlar ve cihaz versiyonları arasındaki farklılıklar, analizin genel hassasiyetini etkileyebilir.
Çok az sayıda proteomik veri analiz yazılımı, manuel ayarlama veya düzeltme olmaksızın aşağıdan yukarıya yöntemlerle histonların analizinde kullanım için yeterli görülmüştür 27,28,29. Sonuçlar (en azından ilk başta) manuel analiz kullanılarak doğrulanmalıdır ve bu da zaman alıcıdır. Analitik yazılım kullanılıyorsa, genellikle onaylanması veya reddedilmesi kolay olan MS/MS açıklama yeteneklerine sahip olmalıdır.
Ayrıca, bir TIMS hücresi yerleştirilmedikçe ve hareketlilik değerleri kullanılmadıkça izomerleri kütle spektrometresi yoluyla ayırmanın imkansız olduğunu belirtmekte fayda var; örneğin, histon modifikasyonlarının konumları, parçalanma desenleri (PASEF) kullanılarak belirlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Melvin A. Park ve Matthew Willetts, timsTOF cihazının üreticisi olan Bruker Daltonics Inc.'in çalışanlarıdır.
Acknowledgments
Bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı tarafından Hibe No kapsamında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. HRD-1547798 ve Hibe No. HRD-2111661. Bu NSF Hibeleri, Bilim ve Teknolojide Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri (CREST) Programının bir parçası olarak Florida Uluslararası Üniversitesi'ne verildi. Bu, Florida Uluslararası Üniversitesi'nde Seçkin Bir Program olan Çevre Enstitüsü'nden 1672 numaralı katkıdır. Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından Hibe No. kapsamında ek destek sağlanmıştır. R21AI135469 Francisco Fernandez-Lima ve Grant No. R01HD106051 Benjamin A. Garcia'ya ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından Hibe No. CHE-2127882'den Benjamin A. Garcia'ya. Yazarlar, ilk yöntem geliştirmeleri sırasında Dr. Mario Gomez Hernandez'in ilk desteğini kabul etmek isterler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -80 °C Freezer | |||
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin-Free |
| 1 mL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL |
| 10 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked |
| 10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution |
| 10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 200 µL Gel-Loading Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL |
| 200 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 352070 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 96-well flat bottom plate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| 96-well plate, V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Acetonitrile (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher Chemical |
| Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF hydrochloride, 98% |
| Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥99.5% (T) |
| Ammonium hydroxide solution, NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS |
| Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH C18 HPLC column | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Heat shock fraction, pH 7, ≥98% |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anhydrous, powder, ≥97% |
| Cell dissociation buffer | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
| Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| Disposable Cell Lifters | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers |
| Disposable Pellet Pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| Formic acid (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagent, ≥96% |
| Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD | (Molex (Polymicro) | TSP075375 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
| Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
| High-Performance Liquid Chromatograph | Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System | |
| Hydrochloric acid, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS reagent, 37% |
| Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Hypersep cartridge | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥98% |
| Methanol, for HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima for HPLC, Fisher Chemical |
| Microcentrifuge Tube Adapters | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
| MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | LEAP PAL Parts | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | model: ND3300 | |
| Nitrogen (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| pH indicator strips, Instachek | Micro Essential Lab | JR-113 | Model: Hydrion |
| Potassium chloride, KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagent, 99.0%–100.5% |
| Pressure Injection Cell | Next Advance | model: PC77 | |
| Propionic Anhydride | Sigma Aldrich | 8.00608 | For synthesis |
| Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) | NuAire, model: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells |
| Sodium butyrate | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| SPE disk, C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm |
| SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor | Savant | model: SC210A | |
| Sucrose | Millipore | 1.07651 | suitable for microbiology |
| Sulfuric acid, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
| Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Suitable for HPLC, ≥99.0% |
| Triversa Nanomate | Advion | model: TR263 | |
| TrypsinProtease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Tube rotator | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
References
- Zhao, Z., Shilatifard, A.
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
- Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
- Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
- Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
- Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T.
- Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
- Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
- Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
- Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
- Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
- Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
- Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
- Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
- Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
- Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
- Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
- Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
- Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
- Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
- Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
- Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
- Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
- Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
- Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).
