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Medicine

Hyperglycemic क्लैंप और Hypoglycemic दबाना सचेत चूहों में

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65581
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

Summary

एक हाइपरग्लाइसेमिक क्लैंप का उपयोग उच्च रक्त शर्करा एकाग्रता के साथ इंसुलिन रिलीज को मापने के लिए किया जाता है। एक हाइपोग्लाइसेमिक क्लैंप काउंटर-नियामक प्रतिक्रियाओं द्वारा प्रेरित ग्लूकोज उत्पादन को मापने के लिए है। दोनों विधियां एक ही सर्जिकल प्रक्रिया का उपयोग करती हैं। यहां, हम प्रणालीगत ग्लूकोज चयापचय का आकलन करने के लिए एक क्लैंप तकनीक प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

मधुमेह मेलेटस (डीएम) अग्नाशयी β-कोशिकाओं (टाइप 1 डीएम) से अपर्याप्त इंसुलिन रिलीज और मांसपेशियों, यकृत और वसा ऊतकों (टाइप 2 डीएम) में इंसुलिन संवेदनशीलता के कारण होता है। इंसुलिन इंजेक्शन डीएम रोगियों का इलाज करता है लेकिन साइड इफेक्ट के रूप में हाइपोग्लाइसीमिया की ओर जाता है। कोर्टिसोल और कैटेकोलामाइन को हाइपोग्लाइसीमिया को पुनर्प्राप्त करने के लिए यकृत से ग्लूकोज उत्पादन को सक्रिय करने के लिए जारी किया जाता है, जिसे काउंटर-नियामक प्रतिक्रियाएं (सीआरआर) कहा जाता है। कृंतक मॉडल का उपयोग करके डीएम अनुसंधान में, ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण और 2-डीऑक्सी-ग्लूकोज इंजेक्शन का उपयोग क्रमशः इंसुलिन रिलीज और सीआरआर को मापने के लिए किया जाता है। हालांकि, प्रयोगों के दौरान रक्त शर्करा सांद्रता लगातार बदलती रहती है, जिससे शुद्ध इंसुलिन रिलीज और सीआरआर का आकलन करने में कठिनाई होती है। यह लेख एक विधि का वर्णन करता है जिसमें रक्त ग्लूकोज को क्रमशः इंसुलिन और सीआरआर हार्मोन की रिहाई की तुलना करने के लिए सचेत चूहों में 250 मिलीग्राम / डीएल या 50 मिलीग्राम / डीएल पर रखा जाता है।

पॉलीथीन टयूबिंग चूहों की मन्या धमनी और जुगुलर नस में प्रत्यारोपित किया जाता है, और चूहों सर्जरी से उबरने के लिए अनुमति दी जाती है. जुगुलर नस टयूबिंग एक निरंतर और परिवर्तनीय दर पर इंसुलिन या ग्लूकोज जलसेक को सक्षम करने के लिए एक सिरिंज पंप के साथ हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ा हुआ है। कैरोटिड धमनी टयूबिंग रक्त संग्रह के लिए है। हाइपरग्लाइसेमिक क्लैंप के लिए, 30% ग्लूकोज नस में डाला जाता है, और रक्त शर्करा का स्तर धमनी रक्त से हर 5 मिनट या 10 मिनट में मापा जाता है। 30% ग्लूकोज की जलसेक दर तब तक बढ़ जाती है जब तक कि रक्त शर्करा का स्तर 250 मिलीग्राम / डीएल न हो जाए। इंसुलिन सांद्रता को मापने के लिए रक्त एकत्र किया जाता है। हाइपोग्लाइसेमिक क्लैंप के लिए, 10 एमयू / किग्रा / मिनट इंसुलिन को 30% ग्लूकोज के साथ संक्रमित किया जाता है, जिसकी जलसेक दर रक्त शर्करा के स्तर के 50 मिलीग्राम / डीएल को बनाए रखने के लिए परिवर्तनशील है। काउंटर-नियामक हार्मोन को मापने के लिए रक्त एकत्र किया जाता है जब ग्लूकोज जलसेक और रक्त ग्लूकोज दोनों स्थिर स्थिति में पहुंच जाते हैं। हाइपरग्लाइसेमिक और हाइपोग्लाइसेमिक क्लैंप दोनों में एक ही सर्जिकल प्रक्रिया और प्रयोगात्मक सेटअप होते हैं। इस प्रकार, यह विधि प्रणालीगत ग्लूकोज चयापचय के शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है।

Introduction

ग्लूकोज कोशिकाओं के लिए ऊर्जा का एक महत्वपूर्ण स्रोत है, और ग्लूकोज की कमी से विभिन्न प्रकार के लक्षण और जटिलताएं हो सकती हैं। कम ग्लूकोज की स्थिति में (हाइपोग्लाइसीमिया, आमतौर पर उपवास रक्त शर्करा के स्तर में 70 मिलीग्राम / डीएल से कम, लेकिन एक एकल मूल्य1 द्वारा निर्धारित नहीं किया जाना चाहिए), सबसे आम लक्षणों में कमजोरी, भ्रम, पसीना और सिरदर्द शामिल हैं। यह मस्तिष्क समारोह को भी बाधित कर सकता है और हृदय संबंधी घटनाओं और मृत्यु दर के जोखिम को बढ़ा सकताहै। इसके विपरीत, हाइपरग्लेसेमिया एक चिकित्सा स्थिति है जिसमें प्लाज्मा ग्लूकोज एकाग्रता सामान्य स्तर से अधिक हो जाती है (आमतौर पर उपवास रक्त शर्करास्तर 3 में 126 मिलीग्राम / डीएल >)। यह मधुमेह वाले व्यक्तियों में हो सकता है जिनके पास इंसुलिन उत्पादन या उपयोग में कमी है। हाइपरग्लेसेमिया मधुमेह केटोएसिडोसिस का कारण बन सकता है, जो तब होता है जब शरीर ऊर्जा के लिए ग्लूकोज का उपयोग नहीं कर सकता है, बल्कि ईंधन के लिए फैटी एसिड को तोड़ देता है। हाइपरग्लाइसेमिक हाइपरोस्मोलर राज्य भी मृत्यु दर बढ़ाताहै 4. लंबे समय तक हाइपरग्लेसेमिया रक्त वाहिकाओं, नसों और अंगों को नुकसान पहुंचा सकता है, जिससे हृदय रोग, रेटिनोपैथी और गुर्दे की बीमारियों जैसी कई पुरानी जटिलताओं का विकास हो सकता है। इस प्रकार, रक्त शर्करा की एकाग्रता को 100 मिलीग्राम / डीएल और 120 मिलीग्राम / डीएल के बीच एक तंग सीमा में बनाए रखा जाना चाहिए।

रक्त ग्लूकोज को एक-डिब्बे मॉडल(चित्रा 1ए)में ग्लूकोज इनपुट और आउटपुट के बीच संतुलन द्वारा नियंत्रित किया जाता है। ग्लूकोज इनपुट में भोजन से अवशोषित ग्लूकोज और यकृत, गुर्दे और छोटी आंत से ग्लूकोज उत्पादन शामिल है। ग्लूकोज आउटपुट में ऊतकों में ग्लूकोज तेज और गुर्दे से ग्लूकोज निपटान शामिल है। ग्लूकोज इनपुट और आउटपुट दोनों की मात्रा अंतःस्रावी हार्मोन द्वारा नियंत्रित होती है। उदाहरण के लिए, ग्लूकागन, कॉर्टिकोस्टेरोन और कैटेकोलामाइन, जिन्हें काउंटर-नियामक हार्मोन के रूप में जाना जाता है, तब जारी किए जाते हैं जब रक्त शर्करा का स्तर5 कम हो जाता है। वे ग्लाइकोजन के टूटने और ग्लूकोज के संश्लेषण को उत्तेजित करते हैं, मुख्य रूप से यकृत से; इन प्रक्रियाओं को क्रमशः ग्लाइकोजेनोलिसिस और ग्लूकोनोजेनेसिस के रूप में जाना जाता है। हाइपरग्लेसेमिया अग्नाशयी β कोशिकाओं से इंसुलिन रिलीज को बढ़ाता है और मांसपेशियों, वसा ऊतकों और हृदय 6,7,8,9में ग्लूकोज तेज को उत्तेजित करता है। व्यायाम इंसुलिन-स्वतंत्र ग्लूकोज तेजबढ़ाता है 10. सहानुभूति तंत्रिका तंत्र मांसपेशियों और भूरे रंग के वसा ऊतक 6,11 में ग्लूकोज तेज बढ़ जाती है. परिधीय ऊतकों में ग्लूकोज चयापचय को विनियमित करने की क्षमता को मापने के लिए, शोधकर्ता आमतौर पर ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (जीटीटी) और इंसुलिन सहिष्णुता परीक्षण (आईटीटी)(चित्रा 1बी,सी)का उपयोग करते हैं। जीटीटी में, दो कारकों पर विचार किया जाना चाहिए: इंसुलिन रिलीज और इंसुलिन संवेदनशीलता (चित्रा 1 बी)। हालांकि, 120 मिनट परीक्षण के दौरान ग्लूकोज एकाग्रता वक्र प्रत्येक माउस में अलग है, जो हार्मोन रिलीज के विभिन्न मात्रा को प्रभावित कर सकते हैं. आईटीटी में, रक्त शर्करा को इंसुलिन संवेदनशीलता और काउंटर-नियामक हार्मोन की रिहाई दोनों द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसलिए, जीटीटी और आईटीटी में ग्लूकोज चयापचय, इंसुलिन रिलीज और इंसुलिन संवेदनशीलता का सटीक अर्थ निर्धारित करना मुश्किल है, ऐसी स्थितियों में जहां रक्त शर्करा का स्तर स्थिर नहीं है।

इन समस्याओं को दूर करने के लिए, रक्त शर्करा को निरंतर स्तर (या "क्लैंप") पर रखना वांछनीय है। हाइपरग्लाइसेमिक क्लैंप में, रक्त शर्करा के स्तर को एक विशिष्ट स्तर तक बढ़ाने के लिए ग्लूकोज को रक्तप्रवाह में डाला जाता है और फिर उस स्तर पर कुछ समय के लिए बनाए रखा जाता है। संक्रमित ग्लूकोज की मात्रा एक स्थिर स्थिति बनाए रखने के लिए हर 5-10 मिनट में रक्त शर्करा के स्तर के माप के आधार पर समायोजित किया जाता है। यह तकनीक एक क्लैंप ग्लूकोज स्तर पर इंसुलिन स्राव के मापदंडों को समझने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। हाइपोग्लाइसेमिक क्लैंप इंसुलिन को संक्रमित करके निम्न रक्त शर्करा के स्तर को बनाए रखने की एक विधि है। एक विशिष्ट रक्त शर्करा स्तर को बनाए रखने के लिए ग्लूकोज को एक चर दर पर संक्रमित किया जाता है। यदि माउस हाइपोग्लाइसीमिया से ठीक नहीं हो सकता है, तो अधिक ग्लूकोज को संक्रमित किया जाना चाहिए।

हालांकि वहाँ hyperglycemic और hypoglycemic clamps प्रदर्शन करने के लिए कई फायदे हैं, शल्य चिकित्सा और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं तकनीकी रूप से मुश्किल माना जाता है. इस प्रकार, कुछ शोध समूह उन्हें करने में सक्षम हैं। हमने कम बजट पर इन प्रयोगों को शुरू करने के लिए वित्तीय और कार्यबल की कमी वाले शोधकर्ताओं के लिए इन तरीकों का वर्णन करने का लक्ष्य रखा है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को कुमामोटो विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

नोट: दर्द से राहत के लिए, इबुप्रोफेन को 48 घंटे के लिए पीने के पानी (0.11 मिलीग्राम / एमएल) में दिया गया था, और ब्यूप्रेनोर्फिन (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) सर्जरी से 30 मिनट पहले दिया गया था। बाँझ स्थितियों में दस्ताने, मास्क और जानवरों के बीच एथिलीन ऑक्साइड के साथ निष्फल उपकरण शामिल हैं। सर्जरी 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग पैड सेट पर किया गया था और प्रत्येक जानवर के लिए एक नई प्रयोगशाला चटाई द्वारा कवर किया गया था। सर्जरी से पहले, सर्जिकल क्षेत्र को बीटाडीन समाधान और शराब से साफ किया गया था। सभी सर्जिकल उपकरणों को एक आटोक्लेव (दो से अधिक सर्जरी के लिए) के साथ निष्फल किया गया था। चीरा बनाने से पहले, चूहों को यह सुनिश्चित करने के लिए जाँच की गई कि वे पूरी तरह से संवेदनाहारी थे। प्रत्येक माउस के लिए संज्ञाहरण की गहराई से पहले और एक पैर की अंगुली चुटकी द्वारा सर्जरी के दौरान मूल्यांकन किया गया था. अनुकूलन अवधि हर बार 5 मिनट से अधिक नहीं थी। संबंधित संस्थान में IACUC के निर्देशों का पालन करें।

1. गले नस और मन्या धमनी के लिए ट्यूबिंग की तैयारी

  1. सभी ट्यूबिंग, पॉलीप्रोपाइलीन आपूर्ति (जैसे, पिपेट टिप्स), और एक आटोक्लेव या एथिलीन ऑक्साइड के साथ टांके को स्टरलाइज़ करें। जुगुलर नस के लिए, गोंद (चित्रा 2 ए) का उपयोग करके ट्यूबिंग 1 के 8 सेमी (सामग्री देखें) और टयूबिंग 2 के 3 सेमी कनेक्ट करें। शीर्ष पर टयूबिंग 1 के 2 मिमी रखो क्योंकि ट्यूबिंग 2 (पॉलीथीन) बहुत कठिन है और रक्त वाहिकाओं (ट्यूबिंग 1.1) को नुकसान पहुंचा सकता है।
  2. ग्लूकोज और इंसुलिन को संक्रमित करने के लिए जुगुलर नस (ट्यूबिंग 1.2) के लिए एक्सटेंशन ट्यूब
    1. टयूबिंग2(चित्रा 2ए)के साथ दो 30 सेमी ट्यूब और एक 10 सेमी ट्यूब तैयार करें। एक 20 माइक्रोन विंदुक टिप (या कुछ भी है कि आयुध डिपो < साथ एक संकीर्ण टिप अंत है कि टयूबिंग 1.1 के साथ कनेक्ट करने के लिए 0.5 मिमी) के तेज अंत काट लें और इसमें एक साथ तीन ट्यूबिंग 2 (30 सेमी, 30 सेमी, और 10 सेमी) जगह है. चिपकने वाला गोंद के साथ सील।
    2. टयूबिंग 2 के दूसरे छोर पर टयूबिंग 1 के 5 सेमी रखें।
  3. कैरोटिड धमनी (ट्यूबिंग 1.3) के लिए: इसे पतला बनाने के लिए टयूबिंग2 खींचें। टयूबिंग के 8 सेमी कनेक्ट करें1 और फैला हुआ टयूबिंग के 3 सेमी2गोंद (चित्रा 2ए)का उपयोग कर. टिप से 9 मिमी पर एक निशान बनाओ.
  4. गैर-तेज अंत के साथ सुई जो टयूबिंग को सिरिंज से जोड़ती है: धातु की फाइल के साथ सुई (23 जी) के तेज अंत के पास एक खरोंच बनाएं, धीरे से इसे सरौता के साथ कुछ बार आगे और पीछे मोड़ें, और इसे तोड़ दें। धातु कनेक्टर (चित्रा 2 ए) का एक टुकड़ा बनाने के लिए सुई के बीच में एक ही कटौती करो।
  5. रक्त खींचने के लिए धमनी के लिए एक्सटेंशन ट्यूब (ट्यूबिंग सेट 1.4): धातु कनेक्टर और गैर-तेज सुई के साथ टयूबिंग 1 के 10 सेमी कनेक्ट करें जो चरण 1.4 में बनाया गया था।
    नोट: सभी ट्यूबिंग और टांके एक आटोक्लेव या एथिलीन ऑक्साइड के साथ निष्फल कर रहे हैं

2. सर्जरी

  1. आइसोफ्लुरेन (1.5-2.0%) या केटामाइन/xylazine (केटामाइन 10 मिलीग्राम/एमएल, 0.9% बाँझ खारा में xylazine 1 मिलीग्राम/एमएल, इंट्रापेरिटोनियल [आईपी] इंजेक्शन के माध्यम से शरीर के वजन (बीडब्ल्यू) के 0.1 एमएल/10 ग्राम के साथ एक माउस को एनेस्थेटाइज करें)। शारीरिक तनाव को कम करने के लिए गर्म पैड (37 डिग्री सेल्सियस) पर माउस रखें. 5-10 मिनट के लिए गहरी संज्ञाहरण के लिए प्रतीक्षा करें. पेडल पलटा, श्वसन, और दिल की दर, और पैर की अंगुली चुटकी द्वारा उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। सर्जरी के दौरान, संज्ञाहरण के निरंतर साँस लेना के लिए ऑपरेटिंग टेबल पर नाक टोपी को सुरक्षित करने के लिए सर्जिकल टेप का उपयोग किया जाना चाहिए। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें।
  2. टयूबिंग1.1 और 1.3 में हेपरिनाइज्ड खारा (100 यू/एमएल) भरें और उन्हें एक गैर-तेज सुई(चित्रा 2बी)के साथ 1 एमएल सिरिंज से कनेक्ट करें। टयूबिंग 3 के अंत को बंद करें ( सामग्री की तालिकादेखें) इसे टांका लगाने वाले लोहे के साथ पिघलाकर, जिसका उपयोग टयूबिंग1.1 और टयूबिंग1.3के लिए कैप के रूप में किया जाएगा।
  3. दाढ़ी और बाँझ 70% शराब के साथ एक पूर्व तैयारी के बाद 10% betadine के तीन चक्र के साथ पहली (पीठ पर interscapular) और दूसरे (सामने में गर्दन) चीरा क्षेत्र पोंछ. उरोस्थि के लिए एक छोटा ऊर्ध्वाधर midline चीरा 5 मिमी सेफेलिक बनाओ, ऊतकों कुंद काटना, और धमनी बेनकाब. वेगस तंत्रिका को धमनी से अलग करें। यह ग्लूकोज चयापचय पर वेगस तंत्रिका को हटाने के नकारात्मक प्रभावों को कम करता है।
    नोट: उदर चीरा से कदम जहां कैथेटर नस में डाला जाता है और रेशम टांके के साथ सुरक्षित एक खुर्दबीन के तहत किया जाता है करने के लिए कदम.
  4. धमनी के नीचे दो रेशम टांके रखें। कपाल पक्ष (चित्रा 2 सी -1) पर कसकर एक सिवनी बांधकर रक्त प्रवाह को रोकें और दुम की तरफ दूसरे शिथिल (चित्रा 2 सी -2), जो रक्त प्रवाह को रोकने के लिए पर्याप्त है लेकिन बाद में फिर से खोलने के लिए पर्याप्त है। धमनी के नीचे एक और सिवनी रखें (चित्र 2C-3)।
  5. वसंत कैंची के साथ चित्रा 2 सी -1 के पास धमनी में कटौती और धमनी में टयूबिंग1.3 जगह. धमनी और टयूबिंग दोनों पर एक ढीली टाई बनाएं (चित्र 2सी-3, मजबूती से टाई न करें। टयूबिंग धमनी में गहरी डाला जाएगा)। ट्यूब डालने के लिए दुम की तरफ गाँठ खोलें (चित्र 2सी-2) जब तक कि 9 मिमी का निशान बीच में गाँठ तक न पहुँच जाए (चित्र 2सी-3)। सुरक्षित रूप से सभी संयुक्ताक्षर टाई और heparinized बाँझ खारा के साथ फ्लश.
  6. जुगुलर कैथेटर के लिए सही कैरोटिड धमनी के रूप में एक ही चीरा से सही जुगुलर नस का पर्दाफाश करें। कपाल अंत को अलग करें और इसे रेशम सिवनी (चित्रा 2 डी-1, सामग्री की तालिका) के साथ बांधें। उजागर नस (चित्रा 2 डी -2) के दुम अंत में सीवन का एक और टुकड़ा रखें. वसंत कैंची के साथ निशान चित्रा 2 डी -1 के पास नस काटें।
  7. कैथेटर डालें (मर्मज्ञ वाहिकाओं को रोकने के लिए बहुत गहरा नहीं), इसे बांधें, और नेत्रहीन पुष्टि करें कि यह रक्त का नमूना है। हेपरिनाइज्ड बाँझ खारा (0.2 एमएल) के साथ फ्लश करें और नेत्रहीन पुष्टि करें कि कैथेटर में कोई रक्त नहीं रहता है।
  8. पहले घाव से संक्रमण को रोकने के लिए नए बाँझ सर्जिकल ड्रेप पर माउस रखें। माउस पर बारी, betadine बाँझ शराब के साथ एक शल्यक्रिया तैयारी के बाद betadine के तीन चक्रों के साथ पोंछ, और कंधे ब्लेड के बीच एक छोटे से चीरा बनाने.
  9. उदर पक्ष के लिए पीठ पर चीरा से त्वचा के नीचे एक सुई धारक पास. सुई धारक के साथ कैथेटर दबाना, उन्हें त्वचा के नीचे से गुजारें, और उन्हें वापस लाएं। चीरा साइट को साफ करें और सिंथेटिक सिवनी (व्यास 0.15-0.2 मिमी) के साथ उदर चीरों को बंद करें। कंधे ब्लेड के बीच चीरा स्थल पर माइक्रो serrefine के साथ शिरापरक कैथेटर दबाना.
  10. कैथेटर को क्लैंप से 1 सेमी ऊपर काटें, इसे हेपरिनाइज्ड खारा के साथ फ्लश करें, और इसे एक टोपी (चरण 2.4) के साथ बंद करें। धमनी कैथेटर के लिए एक ही प्रक्रिया का पालन करें. एक सिंथेटिक सिवनी (व्यास 0.15-0.2 मिमी) के साथ पृष्ठीय चीरा बंद करें.
  11. माउस को गर्म, साफ पिंजरे में रखें (चित्र 2ई)। दैनिक पश्चात देखभाल करें।

3. वसूली

  1. माउस को सिंगल-हाउस करें क्योंकि एक और माउस समूह आवास में कैथेटर काट सकता है।
    1. सामाजिक अलगाव द्वारा तनाव को कम करने के लिए, चूहों को पर्यावरण संवर्धन (जैसे, आश्रयों) के साथ रखें। दैनिक पश्चात देखभाल करें। दर्द, संकट और परेशानी को दूर करने के लिए, एनाल्जेसिया (पीने के पानी में इबुप्रोफेन (0.11 मिलीग्राम / एमएल) सहित पोस्टऑपरेटिव देखभाल प्रदान करें।
    2. संक्रमण के संकेतों के लिए चूहों का निरीक्षण करें, जैसे कि चीरा स्थल पर उत्सव, सुस्ती या दर्द। अधिकांश स्वस्थ चूहों चलना शुरू और सर्जरी के बाद के बारे में 2 घंटे खिला. एक कूबड़ वाला आसन, झालरदार फर, और भोजन का सेवन कम होना दर्द का संकेत हो सकता है। यदि ये संकेत देखे जाते हैं, तो चूहों को गहरी संज्ञाहरण या कार्बन डाइऑक्साइड श्वासावरोध के तहत तुरंत सिर काटकर इच्छामृत्यु दें।
  2. रक्त धमनी में कैथेटर में प्रवेश करेगा और एक थक्का बनाएगा। कैथेटर लाइनों को बनाए रखने के लिए, थक्का दैनिक हटा दें, 3-6 चरणों का पालन करें.
  3. हेपरिनाइज्ड खारा (100 यू / एमएल) के साथ 1 एमएल सिरिंज और 23 जी सुई (गैर-तेज अंत) भरें। एक प्रेरण कक्ष का प्रयोग, isoflurane के साथ हल्के से माउस anesthetize (1.0% -1.5%). फिर, कक्ष से माउस को हटा दें और नाक टोपी के साथ आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण के तहत थक्का हटाने का प्रदर्शन करें।
  4. माइक्रो सेरेफाइन के साथ माउस की पीठ पर धमनी के लिए टयूबिंग दबाना, टोपी को हटा दें, और रक्त और थक्के निकालने. एक 23 जी सुई (गैर तेज अंत) के साथ एक और 1 एमएल सिरिंज का उपयोग कर हेपरिनाइज्ड खारा के साथ कैथेटर फ्लश और यह फिर से टोपी. गंभीर थक्के के मामले में धमनी रेखा की तरह शिरापरक रेखा को साफ करें।
  5. 3-5 दिनों के लिए दिन में एक बार कैथेटर को साफ करने के लिए एक ही प्रक्रिया करें।
  6. माउस के शरीर के वजन की जाँच करें। यदि सर्जरी के दिन से शरीर का वजन 10% से अधिक कम हो जाता है, तो सहायक देखभाल लागू करें और सामान्य शरीर की स्थिति स्कोर में सुधार करने का प्रयास करें, और एक और प्रयोग के लिए माउस का उपयोग करें।
    नोट: इस अध्ययन में प्रयोगों में जानवरों का वजन घटाने 10% से कम था। वजन घटाने प्रणालीगत ग्लूकोज चयापचय को दृढ़ता से प्रभावित करेगा। इस प्रकार, शरीर के वजन की वसूली के लिए इंतजार करने या क्लैंप प्रयोग से हटाने की सिफारिश की जाती है।

4. पंप सिस्टम सेट करें (हाइपोग्लाइसेमिक क्लैंप के लिए)

  1. 0.1% बीएसए खारा में 1 यू/एमएल इंसुलिन, खारा में 30% ग्लूकोज, और हेपरिनाइज्ड खारा तैयार करें।
  2. माउस के शरीर के वजन को मापें। इंसुलिन इन्फ्यूसेट (10 एमयू / किग्रा / मिनट) बनाने के लिए 1 यू/एमएल इंसुलिन के लिए मात्रा की गणना करें। क्लैंप प्रयोग में चूहों में इंसुलिन समाधान के 1.7 माइक्रोन / 300 माइक्रोन इंसुलिन इन्फ्यूसेट बनाने के लिए, 1 यू/एमएल इंसुलिन (μL) के लिए आवश्यक मात्रा 2.647 (μL/g) x शरीर का वजन (g) है। इंसुलिन इन्फ्यूसेट के 300 माइक्रोन की मात्रा 1 माउस पर क्लैंप प्रयोग को समाप्त करने के लिए पर्याप्त है। तालिका 1 इंसुलिन इन्फ्यूसेट बनाने का एक उदाहरण दिखाती है।
  3. प्रत्येक हैमिल्टन सिरिंज में इंसुलिन इन्फ्यूसेट और 30% ग्लूकोज भरें, उन्हें टयूबिंग 1.2 से कनेक्ट करें, और सिरिंज पंप (चित्रा 3ए)पर सिरिंज सेट करें। टयूबिंग 1.2 में प्रत्येक समाधान भरें. एक 1 एमएल सिरिंज और टयूबिंग सेट 1.4(चित्रा 2ए)में खारा भरें।
  4. माउस को आइसोफ्लुरेन (1.0% -1.5%) के साथ एनेस्थेटाइज करें और टयूबिंग1.2 को शिरापरक कैथेटर और टयूबिंग सेट1.4 को धमनी कैथेटर(चित्रा 3ए)से कनेक्ट करें। ट्यूबों को एक साथ रखने के लिए सिलोफ़न टेप का उपयोग करें।
  5. एक खाली 500 एमएल बीकर में माउस रखें.
    नोट: हाइपरग्लाइसेमिक क्लैंप के लिए, 1 यू/एमएल इंसुलिन के बजाय खारा का उपयोग करें।

5. हाइपोग्लाइसेमिक क्लैंप

  1. चित्रा 3 बी में दिखाया गया के रूप में हर 5-10 मिनट रक्त शर्करा के स्तर को मापें, और -15 मिनट, 10 मिनट, 20 मिनट, 40 मिनट, 60 मिनट, 80 मिनट, 100 मिनट, और 120 मिनट पर हार्मोन माप के लिए रक्त के नमूने एकत्र. रक्त शर्करा को मापने के लिए चरण 5.2 का पालन करें।
    नोट: हर समय बिंदुओं पर रक्त शर्करा को मापना आवश्यक नहीं है, लेकिन इसे कम से कम हर 10 मिनट में मापने की सिफारिश की जाती है। हर 5 मिनट में रक्त शर्करा को मापें जब इसका स्तर और ग्लूकोज जलसेक दर स्थिर न हो।
  2. टयूबिंग सेट 1.4 के शीर्ष छोर को दबाना और एक नई सिरिंज कनेक्ट करें, रक्त के 50 माइक्रोन निकालें, और इसे धोने के लिए 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। रक्त शर्करा के स्तर को मापें।
    नोट: यह पिछले नमूने के बाद कैथेटर धोने के कारण ट्यूब में खारा समाधान द्वारा पतला रक्त है। शुद्ध रक्त के साथ पतला रक्त को बदलने के लिए 50 माइक्रोन मात्रा पर्याप्त है।
  3. पतला रक्त (लाल रक्त कोशिकाओं) को स्टोर करें। खारा के साथ पूल रक्त (~ 500 माइक्रोन) धो लें (चरण 5.11-5.12 देखें) और हाइपोक्सिया को रोकने के लिए शरीर पर वापस लौटें।
  4. कैथेटर उच्च रक्तचाप के साथ धमनी से जुड़ा होता है, इसलिए जब क्लैंप ढीला हो जाता है, तो रक्त बाहर निकल जाएगा और एक आसान ग्लूकोज मीटर के साथ ग्लूकोज को मापने के लिए उपयोग किया जाएगा। रक्त तरल पदार्थ की पर्याप्त मात्रा रखने के लिए खारा के 50 माइक्रोन को संक्रमित करें।
  5. रक्त के नमूने के लिए, रक्त का एक अतिरिक्त 50 माइक्रोन निकालें और इसे बर्फ पर 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। खारा के 100 माइक्रोन (प्रतिस्थापन के 50 माइक्रोन + नमूने के 50 माइक्रोन) को संक्रमित करें।
  6. रक्त ग्लूकोज माप के 0 मिनट के बाद, इंसुलिन सिरिंज पंप शुरू करें। सबसे पहले, 2 मिनट (5.1 माइक्रोन/मिनट) के लिए बोलस में 30 एमयू/किग्रा/मिनट डालें, फिर शेष अवधि के लिए 10 एमयू/किग्रा/मिनट (1.7 माइक्रोन/मिनट) जलसेक।
  7. रक्त शर्करा के स्तर को मापें और 120 मिनट के लिए हर 5-10 मिनट में ग्लूकोज जलसेक दर बदलें।
  8. एक स्थिर स्थिति बनाएं जहां ग्लूकोज जलसेक दर नहीं बदलती है, और रक्त शर्करा का स्तर 50 मिलीग्राम /
  9. टी = 120 मिनट पर रक्त का नमूना एकत्र करने के बाद, गले नस में एक इच्छामृत्यु एजेंट डालना और शाही सेना या प्रोटीन विश्लेषण के लिए ऊतकों को इकट्ठा.
  10. 5 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर रक्त अपकेंद्रित्र और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एलिसा किट का उपयोग करके इंसुलिन या सी-पेप्टाइड जैसे हार्मोन एकाग्रता को मापें।
  11. रक्त धोने के लिए, 3 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर रक्त अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें, हेपरिनाइज्ड खारा के 500 माइक्रोन जोड़ें, और पाइपिंग करें।
  12. धोने फिर से दोहराना और धमनी के लिए 1 एमएल सिरिंज में धोया लाल रक्त कोशिकाओं जगह है. रक्त कोशिकाओं को स्वचालित रूप से पुन: संक्रमित किया जाएगा जब 5.2 और 5.3 चरणों में खारा के 50 या 100 माइक्रोन को संक्रमित किया जाता है। हाइपोक्सिया को रोकने के लिए हेमटोक्रिट की सावधानीपूर्वक निगरानी करें।
    नोट: रक्त ग्लूकोज माप के लिए, एक वाणिज्यिक आसान ग्लूकोज मीटर का उपयोग किया गया था।

6. हाइपरग्लाइसेमिक क्लैंप

  1. हाइपोग्लाइसेमिक क्लैंप तकनीक के रूप में चरणों का पालन करें, लेकिन इंसुलिन जलसेक के बिना और रक्त शर्करा के साथ 250-300 मिलीग्राम / डीएल तक समायोजित किया गया। चित्रा 3 बी में दिखाया गया के रूप में हर 5-10 मिनट रक्त शर्करा के स्तर को मापें, और -15 मिनट, 10 मिनट, 20 मिनट, 40 मिनट, 60 मिनट, 80 मिनट, 100 मिनट, और 120 मिनट पर हार्मोन माप के लिए रक्त के नमूने एकत्र.
  2. टयूबिंग सेट1.4 में एक नई सिरिंज कनेक्ट करें, रक्त के 50 माइक्रोन निकालें, और इसे धोने के लिए 1.5 एमएल ट्यूब में रखें।
  3. रक्त के नमूने के लिए, रक्त का एक अतिरिक्त 50 माइक्रोन निकालें और इसे बर्फ पर 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। खारा के 100 माइक्रोन (प्रतिस्थापन के 50 माइक्रोन + नमूने के 50 माइक्रोन) को संक्रमित करें।
  4. रक्त ग्लूकोज माप के 0 मिनट के बाद, ग्लूकोज सिरिंज पंप शुरू करें। सबसे पहले, 2 मिनट (5.1 माइक्रोन/मिनट) के लिए बोलस में 30 ग्राम/किग्रा/मिनट डालें, फिर शेष अवधि के लिए 10 ग्राम/किग्रा/मिनट (1.7 माइक्रोन/मिनट)।
  5. रक्त शर्करा के स्तर को मापें और 120 मिनट के लिए हर 5 -10 मिनट में ग्लूकोज जलसेक दर बदलें। एक स्थिर स्थिति बनाएं जहां ग्लूकोज जलसेक दर नहीं बदलती है, और रक्त शर्करा का स्तर 250-300 मिलीग्राम / डीएल है, एक क्लैंप हाइपरग्लाइसेमिक राज्य।

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Representative Results

हाइपोग्लाइसेमिक क्लैंप अध्ययन पुरुष C57BL/6N चूहों (8 सप्ताह पुराना, 25 ग्राम बीडब्ल्यू से अधिक) 3 घंटे प्रयोग की शुरुआत में उपवास किया गया था (चित्र 4A,B)। प्रारंभिक रक्त शर्करा का स्तर 136 मिलीग्राम / डीएल (टी = -15 मिनट) था। यदि यह 90 मिलीग्राम / डीएल से कम है, तो यह या तो हो सकता है क्योंकि सर्जरी अच्छी तरह से नहीं हुई, या धमनी कैथेटर बहुत गहरा डाला गया था, या रक्त के थक्के रक्त प्रवाह में प्रवेश कर चुके हैं। सर्जरी के बाद माउस हालत माउस में ऊर्जा चयापचय को प्रभावित करता है. शारीरिक ग्लूकोज चयापचय को खराब स्वास्थ्य स्थितियों के तहत नहीं मापा जा सकता है। C57BL सर्जरी के बाद थक्के जमने का खतरा अधिक होता है; जिन चूहों के शरीर का वजन अधिक होता है, जैसे कि एफवीबी या आईसीआर चूहे, सर्जरी के बाद थक्का धोने के कारण वजन कम होने की संभावना कम होती है। इस प्रकार, शुरुआती लोगों के लिए क्लैंप प्रक्रियाओं का अभ्यास करने के लिए FVB चूहों का उपयोग करना बेहतर है। C57BL चूहों को अधिक गहन देखभाल की आवश्यकता होती है। धमनी में 9 मिमी कैथेटर सम्मिलन ने हमें एफवीबी और आईसीआर चूहों में भी रक्त एकत्र करने में कोई परेशानी नहीं दी है। इंसुलिन टी = 0 मिनट पर शुरू किया गया था, और रक्त शर्करा का स्तर (चित्रा 4 ए) में कमी आई है। जीआईआर टी = 0 मिनट और टी = 70 मिनट के बीच स्थिर नहीं था। इसके बाद, यह 80 मिनट के बाद एक स्थिर अवस्था बन गई।

हाइपरग्लाइसेमिक क्लैंप अध्ययन पुरुष C57BL/6N चूहों (8 सप्ताह पुराना, 25 ग्राम बीडब्ल्यू से अधिक) 3 घंटे प्रयोग की शुरुआत में उपवास किया गया था (चित्र 4C,D)। रक्त ग्लूकोज को मापने और टी = -15 और टी = -5 मिनट पर रक्त के नमूने एकत्र करने के बाद, ग्लूकोज टी = 0 मिनट से संक्रमित किया गया था। टी = 40 मिनट पर रक्त शर्करा का स्तर 250 मिलीग्राम / डीएल हो गया। स्थिर अवस्था t = 30 मिनट से अंत तक जारी रही।

Figure 1
चित्र 1: रक्त शर्करा के स्तर का विनियमन। (ए) शरीर में रक्त ग्लूकोज के नियमन को दर्शाने वाला वैचारिक आरेख। (बी, सी) (बी) ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण (जीटीटी) और (सी) इंसुलिन सहिष्णुता परीक्षण (आईटीटी) में ग्लूकोज चयापचय का विनियमन। कई कारक रक्त शर्करा के स्तर को नियंत्रित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: टयूबिंग और सर्जरी के चरणों की तैयारी। (ए) मन्या धमनी और गले नस के लिए ट्यूबिंग की छवियां। टयूबिंग नंबर प्रोटोकॉल स्टेप नंबर से मेल खाते हैं। (बी) सर्जरी के लिए ट्यूबिंग तैयार करने की विधि। (सी, डी) गिने हुए स्थान जहां रेशम के धागे कैथेटर को (सी) धमनी और (डी) नस में डालने के लिए लिगेट किए जाते हैं। कपाल (सी-(1)) और धमनी के दुम पक्ष (सी-(2)) में रेशम के धागे की स्थिति, और उनमें से बीच में एक और (सी-(3)) (प्रक्रिया 2-4)। कपाल (डी- (1)) और नस के दुम पक्ष (डी- (2)) में रेशम के धागे की स्थिति, और उनमें से बीच में एक और (डी- (3)) (प्रक्रिया 2-6)। (ई) पीछे से बाहर निकलने वाली धमनी और शिरापरक कैनुला का आरेख कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: क्लैंप की सेटिंग। (ए) आरेख ट्यूबिंग, पंप, सीरिंज और माउस का सेटअप दिखा रहा है। (बी) रक्त शर्करा के स्तर और ग्लूकोज जलसेक दर को रिकॉर्ड करने के लिए शीट। 50 μL रक्त t = -15 मिनट, 10 मिनट, 20 मिनट, 40 मिनट, 60 मिनट, 80 मिनट, 100 मिनट और 120 मिनट पर एकत्र किया जाता है। इंसुलिन जलसेक दर टी = 0 से 2 मिनट तक 5.1 माइक्रोन/मिनट थी और टी = 2 मिनट में 1.7 में बदल गई। रक्त शर्करा का स्तर हर 10 मिनट में मापा गया था। रक्त ग्लूकोज को हर 5 मिनट में मापा जाता था जब इसका स्तर स्थिर नहीं था। हर बार रक्त शर्करा को मापने पर ग्लूकोज जलसेक दर बदल दी गई थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: हाइपोग्लाइसेमिक क्लैंप और हाइपरग्लाइसेमिक क्लैंप के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) रक्त शर्करा का स्तर और (बी) हाइपोग्लाइसेमिक क्लैंप की ग्लूकोज जलसेक दर। (सी) रक्त शर्करा का स्तर और (डी) हाइपरग्लाइसेमिक क्लैंप की ग्लूकोज जलसेक दर। डेटा SEM ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विलयन गणना 20 ग्राम माउस के लिए
1 यू/एमएल इंसुलिन (2.647 x शरीर का वजन) μL 52.9 माइक्रोन
0.1% बीएसए खारा 300 μL - इंसुलिन की मात्रा (μL) 247.1 माइक्रोन

तालिका 1: इंसुलिन इन्फ्यूसेट तैयार करने के लिए एक उदाहरण गणना।

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Discussion

विधि यहाँ वर्णित एक सरल एक है कि विंदुक युक्तियों, सीरिंज, और अन्य वस्तुओं साधारण प्रयोगशालाओं में पाया के साथ किया जा सकता है. हालांकि शोधकर्ताओं को अतिरिक्त ट्यूब और पंप खरीदने की आवश्यकता हो सकती है, महंगे उपकरण की आवश्यकता नहीं है। इस प्रकार, कैथीटेराइजेशन और क्लैंप का यह प्रोटोकॉल पिछली रिपोर्ट 12,13,14की तुलना में शुरू करना आसान है।

क्लैंप तकनीक 1970 के आसपास विकसित किया गया था और चूहों और मनुष्यों15 में इस्तेमाल किया गया है. यह ग्लूकोज चयापचय को सटीक रूप से मापने के लिए एक उपयोगी तरीका है और इसे स्वर्ण मानक कहा जाता है। हालांकि, यह कई शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग की जाने वाली एक सामान्य तकनीक नहीं है। चूहों13 और चूहों14 में हाइपरिन्सुलिन-यूग्लाइसेमिक क्लैंप तकनीक की सूचना दी गई है, लेकिन यहां कैथीटेराइजेशन की विधि अलग है, और पाठक अपने प्रयोगों के लिए आसान चुन सकते हैं। इस पत्र के उद्देश्यों में से एक प्रयोग शुरू करने के लिए बाधा को कम करने के लिए है. इसलिए, हमने हस्तनिर्मित कैथेटर, सर्जिकल प्रक्रियाओं और प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम के उदाहरण की सामग्री पर विस्तृत जानकारी प्रदान की। ये शोधकर्ता के लिए जानकारीपूर्ण हैं जो पहली बार क्लैंप करने का प्रयास करते हैं।

मोटापे और मधुमेह में इंसुलिन स्राव चरण-निर्भर है। कई रिपोर्टों का सुझाव है इंसुलिन स्राव इंसुलिन प्रतिरोधी राज्य16 में रक्त शर्करा को कम करने के लिए मोटापे में वृद्धि हुई है, लेकिन β सेल समारोह प्रकार 2 डीएम17,18 में क्षतिग्रस्त हो जाएगा. वास्तव में, अग्नाशयी टापू और इंसुलिन स्राव की संख्या और क्षेत्र मोटापा माउस मॉडल में वृद्धि हुई है सूचित किया गया है, इस तरह के चूहों एक उच्च वसा वाले आहार19 या लेप्टिन की कमी चूहों20 के साथ खिलाया के रूप में. इन माउस मॉडल में, जिनमें एक स्पष्ट फेनोटाइप है, जीटीटी में ग्लूकोज प्रशासन के 15-30 मिनट बाद रक्त इंसुलिन के स्तर की जांच करके अंतर निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि, कुछ मामलों में, इंसुलिन स्राव में अंतर निर्धारित करना आसान नहीं है। उदाहरण के लिए, यदि ट्रांसजेनिक (टीजी) चूहों में रक्त शर्करा का स्तर 500 मिलीग्राम / डीएल होता है जबकि डब्ल्यूटी माउस में 300 मिलीग्राम / डीएल होता है और दोनों चूहों में रक्त इंसुलिन का स्तर समान होता है, तो क्या हम कह सकते हैं कि टीजी में इंसुलिन स्राव कम हो जाता है? इस मामले में, हम इंसुलिन स्राव क्षमता की तुलना तब तक नहीं कर सकते जब तक कि यहां पेश की गई विधि का उपयोग करके रक्त शर्करा का स्तर समान न हो। यह एक कारण है कि मोटापे से मधुमेह तक संक्रमण में β-सेल फ़ंक्शन बिगड़ने के बारे में कोई स्थापित सिद्धांत नहीं है। हम अग्न्याशय21 या पूर्व विवो22 की प्राथमिक संस्कृति द्वारा इंसुलिन स्राव को भी माप सकते हैं। हालांकि, यह इंसुलिन रिलीज पर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के प्रभाव को बर्बाद कर देगा क्योंकि वेगस तंत्रिका का संक्रमण हटा दिया जाएगा। अवशोषक इंसुलिन स्राव के बाद अच्छी तरह से जाना जाता है, लेकिन मस्तिष्क और स्वायत्त तंत्रिका तंत्र भी इंसुलिन रिलीज23 को विनियमित. उत्तरार्द्ध का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग एक unanesthetized, अनर्गल, दर्द रहित रक्त संग्रह में किया जाना चाहिए। यही कारण है कि वेगस तंत्रिका को चरण 2.3 में कैरोटिड धमनी से अलग किया जाना है।

मधुमेह मेलेटस इंसुलिन प्रतिरोध और ग्लूकागन24 और अन्य काउंटर-नियामक हार्मोन25 के स्राव में वृद्धि के कारण हाइपरग्लेसेमिया का कारण बताया गया है। इसके अलावा, इंसुलिन खुराक या अन्य कारणों की विफलताओं के कारण मधुमेह के साथ मनुष्यों में हाइपोग्लाइसीमिया के दोहराया एपिसोड आवर्तक हाइपोग्लाइसीमिया नामक एक शर्त को जन्म दे सकते हैं, जिसमें रोगियों को हाइपोग्लाइसीमिया26 का खतरा होता है। यह सुझाव दिया गया है कि हाइपोग्लाइसेमिक क्लैंप में ग्लाइसीमिया में गिरावट की दर हाइपोग्लाइसीमिया27 के परिधीय या केंद्रीय पहचान को प्रभावित करती है। धीमी शुरुआत हाइपोग्लाइसीमिया पोर्टल-मेसेंटेरिक नसों में ग्लूकोज सेंसर की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है, जबकि रक्त शर्करा में बहुत तेजी से कमी मस्तिष्क ग्लूकोज सेंसर27 के अध्ययन के लिए हो सकती है। 1 U/mL इंसुलिन का उपयोग दुबले C57BL चूहों में किया जाता है। लेकिन, मोटे चूहों में एक उच्च इंसुलिन एकाग्रता की आवश्यकता होगी क्योंकि उनके पास इंसुलिन प्रतिरोध है, और 1 यू / एमएल रक्त शर्करा के स्तर को कम करने के लिए पर्याप्त नहीं है।

रक्त ग्लूकोज पूल (चित्रा 1 ए) के एक-डिब्बे मॉडल में, अवशोषित ग्लूकोज की मात्रा ग्लूकोज इनपुट14 की दर को प्रभावित कर सकती है। इस प्रकार, ग्लूकोज उत्पादन की दर, हाइपरिन्सुलिन-यूग्लाइसेमिक क्लैंप को मापने के मुख्य उद्देश्यों में से एक, उपवास की अवधि से प्रभावित हो सकती है। हालांकि, लंबे समय तक उपवास का समय काउंटर-नियामक हार्मोन की रिहाई को बढ़ा सकता है। इसलिए, शोधकर्ता अपने विश्लेषण उद्देश्य के अनुसार उपवास का समय निर्धारित करते हैं। एक अन्य क्लैंप विधि पूंछ से रक्त नमूना शामिल है, जो सरल है क्योंकि केवल एक अंतःशिरा प्रवेशनी14 डाला जा करने की जरूरत है. हालांकि, रक्त एक संयम में एकत्र किया जाता है, जो संयम तनाव की एक मध्यम राशि और प्लाज्मा catecholamines और अन्य तनाव हार्मोन14 में वृद्धि का कारण बनता है. इसके अलावा, चरम सीमाओं पर रक्त के बजाय शरीर के केंद्र में रक्त प्रवाह में हार्मोन सांद्रता को मापना बेहतर होता है। इसलिए, मुक्त चलती चूहों में धमनियों से रक्त का नमूना ग्लूकोज चयापचय को शारीरिक रूप से मापने के लिए सबसे अच्छा है। चूहे इधर-उधर नहीं जाते हैं, और जब वे प्रयोगात्मक वातावरण के अभ्यस्त होते हैं तो कुंडा की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, उलझने वाले जलसेक और नमूना लाइनों को रोकने के लिए एक कुंडा का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। ट्यूबिंग 1.2 और ट्यूबिंग सेट 1.4 (चित्रा 3 ए) एक कुंडा का उपयोग करने के लिए अच्छा नहीं हैं। यदि शोधकर्ता को कुंडा का उपयोग करने की आवश्यकता होती है तो सिस्टम में सुधार किया जाना चाहिए। रक्त कोशिकाओं का सुदृढीकरण रक्त शर्करा और इंसुलिन की स्थापित स्थिर स्थिति को प्रभावित नहीं करता है। वर्तमान विधि को आइसोटोप का उपयोग करके चयापचय अध्ययन पर भी लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि 13सी-ग्लूकोज लगातार नस में डाला जाता है, तो प्रणालीगत चयापचय कारोबार दर और इंट्रासेल्युलर मध्यवर्ती चयापचयों को28मापा जा सकता है। इस प्रकार, यह ग्लूकोज चयापचय का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी तरीका है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को उत्कृष्ट युवा शोधकर्ताओं (MEXT से) के लिए अग्रणी पहल द्वारा समर्थित किया गया था; वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान (बी) (अनुदान संख्या JP21H02352); चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी (AMED-RPIME, अनुदान संख्या JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h999901); उहेरा मेमोरियल फाउंडेशन; चयापचय संबंधी विकारों पर अनुसंधान के लिए एस्टेलस फाउंडेशन; सुजुकेन मेमोरियल फाउंडेशन, अकियामा लाइफ साइंस फाउंडेशन, और नारिशिगे न्यूरोसाइंस रिसर्च फाउंडेशन। हम इस पांडुलिपि के मसौदे को संपादित करने के लिए नूर फरेहान असगर, पीएचडी को भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive glue Henkel AG & Co. KGaA LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide) Morinaga Institute of Bilogical Science Inc M1304 Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 633-03411 LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter Nipro Co. 11-777 Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml) Eli Lilly & Co. 428021014 Humulin R (100U/ml)
Mouse Japan SLC Inc. C57BL/6NCrSlc C57BL
Suture Natsume seisakusho C-23S-560 No.2 Sterilized
Syringe Pump Pump Systems Inc. NE-1000
Synthetic suture VÖMEL HR-17
Tubing1 AS ONE Corporation 9-869-01 LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2 Fisher Scientific 427400 BD Intramedic PE Tubing
Tubing3 IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. size5 Polyethylene tubing size5

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References

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चिकित्सा अंक 203
Hyperglycemic क्लैंप और Hypoglycemic दबाना सचेत चूहों में
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