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Medicine

Clamp hiperglicêmico e grampo hipoglicêmico em camundongos conscientes

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65581
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

Summary

Um clamp hiperglicêmico é usado para medir a liberação de insulina com uma concentração de glicose no sangue mais alta mantida. Uma pinça hipoglicemiante serve para medir a produção de glicose induzida por respostas contra-regulatórias. Ambos os métodos utilizam o mesmo procedimento cirúrgico. Apresentamos aqui uma técnica de clamp para avaliar o metabolismo sistêmico da glicose.

Abstract

O diabetes mellitus (DM) é causado pela liberação insuficiente de insulina das células β pancreáticas (DM tipo 1) e sensibilidade à insulina nos músculos, fígado e tecido adiposo (DM tipo 2). A injeção de insulina trata pacientes com DM, mas leva à hipoglicemia como efeito colateral. O cortisol e as catecolaminas são liberados para ativar a produção de glicose do fígado para recuperar a hipoglicemia, chamadas de respostas contrarregulatórias (CRR). Na pesquisa de DM usando modelos de roedores, testes de tolerância à glicose e injeção de 2-desoxiglicose são usados para medir a liberação de insulina e CRR, respectivamente. No entanto, as concentrações de glicose no sangue mudam persistentemente durante os experimentos, causando dificuldades na avaliação da liberação líquida de insulina e da RCR. Este artigo descreve um método no qual a glicemia é mantida em 250 mg/dL ou 50 mg/dL em camundongos conscientes para comparar a liberação de insulina e hormônios CRR, respectivamente.

A tubulação de polietileno é implantada na artéria carótida e na veia jugular dos camundongos, e os camundongos podem se recuperar da cirurgia. A tubulação da veia jugular é conectada a uma seringa de Hamilton com uma bomba de seringa para permitir a infusão de insulina ou glicose a uma taxa constante e variável. A tubulação da artéria carótida é para coleta de sangue. Para a pinça hiperglicêmica, 30% de glicose é infundida na veia, e os níveis de glicose no sangue são medidos a partir do sangue arterial a cada 5 min ou 10 min. A taxa de infusão de glicose a 30% é aumentada até que o nível de glicose no sangue se torne 250 mg/dL. O sangue é coletado para medir as concentrações de insulina. Para a pinça hipoglicemiante, infunde-se insulina 10 mU/kg/min juntamente com glicose a 30%, cuja velocidade de infusão é variável para manter 50 mg/dL de glicemia. O sangue é coletado para medir os hormônios contrarreguladores quando a infusão de glicose e a glicose no sangue atingem um estado estacionário. Tanto as pinças hiperglicêmicas quanto as hipoglicêmicas têm o mesmo procedimento cirúrgico e montagens experimentais. Assim, este método é útil para pesquisadores do metabolismo sistêmico da glicose.

Introduction

A glicose é uma importante fonte de energia para as células, e a falta de glicose pode levar a uma variedade de sintomas e complicações. No caso de glicose baixa (hipoglicemia, geralmente inferior a 70 mg/dL no nível de glicemia de jejum, mas não deve ser determinada por um único valor1), os sintomas mais comuns incluem fraqueza, confusão, sudorese e dor de cabeça. Também pode interromper a função cerebral e aumentar o risco de eventos cardiovasculares e mortalidade2. Por outro lado, a hiperglicemia é uma condição médica na qual a concentração de glicose plasmática excede os níveis normais (geralmente > 126 mg/dL na glicemia de jejum3). Isso pode ocorrer em indivíduos com diabetes que têm um déficit na produção ou utilização de insulina. A hiperglicemia pode levar à cetoacidose diabética, que ocorre quando o corpo não pode usar a glicose para energia, mas em vez disso, quebra os ácidos graxos como combustível. O estado hiperosmolar hiperglicêmico também aumenta a mortalidade4. A hiperglicemia a longo prazo pode causar danos aos vasos sanguíneos, nervos e órgãos, levando ao desenvolvimento de várias complicações crônicas, como doenças cardiovasculares, retinopatias e doenças renais. Assim, a glicemia deve ser mantida em uma faixa restrita entre 100 mg/dL e 120 mg/dL.

A glicemia é regulada pelo balanço entre a entrada e a saída de glicose em um modelo unicompartimental (Figura 1A). A entrada de glicose inclui a glicose absorvida dos alimentos e a produção de glicose do fígado, rins e intestino delgado. O débito de glicose compreende a captação de glicose nos tecidos e a eliminação de glicose dos rins. Tanto a quantidade de entrada quanto a saída de glicose são reguladas por hormônios endócrinos. Por exemplo, glucagon, corticosterona e catecolaminas, conhecidas como hormônios contrarreguladores, são liberadas quando os níveis de glicose no sangue diminuem5. Eles estimulam a quebra de glicogênio e a síntese de glicose, principalmente a partir do fígado; Esses processos são conhecidos como glicogenólise e gliconeogênese, respectivamente. A hiperglicemia aumenta a liberação de insulina pelas células β pancreáticas e estimula a captação de glicose nos músculos, tecidos adiposos e coração 6,7,8,9. O exercício físico aumenta a captação de glicose insulino-independente10. O sistema nervoso simpático aumenta a captação de glicose nos músculos e no tecido adiposo marrom 6,11. Para medir a capacidade de regular o metabolismo da glicose nos tecidos periféricos, os pesquisadores normalmente usam o teste de tolerância à glicose (GTT) e o teste de tolerância à insulina (ITT) (Figura 1B,C). No GTT, dois fatores devem ser considerados: liberação de insulina e sensibilidade à insulina (Figura 1B). No entanto, a curva de concentração de glicose durante o teste de 120 min é diferente em cada camundongo, o que pode afetar diferentes quantidades de liberação hormonal. No ITT, a glicose no sangue é regulada tanto pela sensibilidade à insulina quanto pela liberação de hormônios contrarreguladores. Portanto, é difícil determinar o significado preciso do metabolismo da glicose, liberação de insulina e sensibilidade à insulina no GTT e ITT, em situações em que os níveis de glicose no sangue não são constantes.

Para superar esses problemas, é desejável manter a glicose no sangue em um nível constante (ou "braçadeira"). No clamp hiperglicêmico, a glicose é infundida na corrente sanguínea para elevar os níveis de glicose no sangue para um nível específico e, em seguida, mantida nesse nível por um período de tempo. A quantidade de glicose infundida é ajustada com base em medições dos níveis de glicose no sangue a cada 5-10 minutos para manter um estado estacionário. Esta técnica é particularmente útil para a compreensão dos parâmetros de secreção de insulina em um nível de glicose clampeada. O clamp hipoglicêmico é um método para manter baixos níveis de glicose no sangue por infusão de insulina. A glicose é infundida a uma taxa variável para manter um nível específico de glicose no sangue. Se o rato não conseguir recuperar da hipoglicemia, deve ser infundida mais glicose.

Embora existam muitas vantagens na realização de pinças hiperglicêmicas e hipoglicêmicas, os procedimentos cirúrgicos e experimentais são considerados tecnicamente difíceis. Assim, poucos grupos de pesquisa conseguiram realizá-las. Nosso objetivo foi descrever esses métodos para que pesquisadores com restrições financeiras e de força de trabalho iniciem esses experimentos com um orçamento menor.

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Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Kumamoto.

NOTA: Para alívio da dor, o ibuprofeno foi administrado em água potável (0,11 mg/mL) por 48 h, e a buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg i.p.) foi administrada 30 minutos antes da cirurgia. As condições estéreis incluem luvas, máscaras e instrumentos autoclavados esterilizados com óxido de etileno entre os animais. A cirurgia foi realizada em uma almofada térmica regulada a 37 °C e coberta por um novo tapete de laboratório para cada animal. Antes da cirurgia, a área cirúrgica foi limpa com solução de betadina e álcool. Todos os instrumentais cirúrgicos foram esterilizados em autoclave (para no máximo duas cirurgias). Antes de fazer a incisão, os camundongos foram verificados para garantir que estavam totalmente anestesiados. A profundidade da anestesia para cada camundongo foi avaliada antes e durante a cirurgia por meio de uma pinça do dedo. O período de aclimatação não foi superior a 5 min cada vez. Siga as instruções da IACUC na respectiva instituição.

1. Preparo de tubos para veia jugular e artéria carótida

  1. Esterilize todos os tubos, suprimentos de polipropileno (por exemplo, pontas de pipeta) e suturas com autoclave ou óxido de etileno. Para a veia jugular, conectar 8 cm de tubing1 (ver Materiais) e 3 cm de tubing2 usando cola (Figura 2A). Coloque 2 mm de tubing1 no topo porque o tubo 2 (polietileno) é muito duro e pode danificar os vasos sanguíneos (Tubing1.1).
  2. Tubo de extensão para veia jugular (Tubing1.2) para infusão de glicose e insulina
    1. Preparar dois tubos de 30 cm e um de 10 cm com tubulação2 (Figura 2A). Corte a extremidade afiada de uma ponta de pipeta de 20 μL (ou qualquer coisa que tenha uma extremidade de ponta estreita com OD < 0,5 mm para conectar com a tubulação 1.1) e coloque três tubos2 (30 cm, 30 cm e 10 cm) juntos nele. Selo com cola adesiva.
    2. Coloque 5 cm de tubing1 na outra extremidade do tubing2.
  3. Para a artéria carótida (Tubing1.3): Esticar a tubulação2 para torná-la mais fina. Conectar 8 cm de tubulação1 e 3 cm de tubulação esticada2 com cola (Figura 2A). Faça uma marca a 9 mm da ponta.
  4. Agulha com extremidade não afiada que conecta a tubulação à seringa: Faça um arranhão perto da extremidade afiada da agulha (23 G) com uma lima de metal, dobre-a suavemente para frente e para trás algumas vezes com um alicate e quebre-a. Faça o mesmo corte no meio da agulha para fazer um pedaço de conector de metal (Figura 2A).
  5. Tubo de extensão para a artéria retirar sangue (Tubing set1.4): Conectar 10 cm de tubing1 com o conector metálico e a agulha não afiada que foi feita no passo 1.4.
    OBS: Todas as tubulações e suturas são esterilizadas em autoclave ou óxido de etileno

2. Cirurgia

  1. Anestesiar camundongos com isoflurano (1,5-2,0%) ou cetamina/xilazina (cetamina 10 mg/mL, xilazina 1 mg/mL em solução salina 0,9% estéril, 0,1 mL/10 g de peso corporal (PC) via injeção intraperitoneal [ip]). Mantenha o rato sobre a almofada quente (37 °C) para reduzir o stress físico. Aguarde anestesia profunda por 5-10 min. Confirme a profundidade da anestesia pelo reflexo pedal, respiração e frequência cardíaca, e resposta aos estímulos por pinça dos dedos. Durante a cirurgia, a fita cirúrgica deve ser usada para fixar a tampa nasal à mesa de cirurgia para inalação contínua de anestesia. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
  2. Preencher solução salina heparinizada (100 U/mL) em tubing1.1 e 1.3 e conectá-los com uma seringa de 1 mL com agulha não cortante (Figura 2B). Feche a extremidade da tubulação3 (ver Tabela de Materiais) fundindo-a com um ferro de solda, que será usado como tampas para tubulação1.1 e tubulação1.3.
  3. Raspar e limpar a área da incisão da primeira (interescapular nas costas) e da segunda (pescoço na frente) com três ciclos de betadina a 10%, seguidos de uma preparação pré-operatória com álcool 70% estéril. Fazer uma pequena incisão vertical de 5 mm cefálica ao esterno, dissecar os tecidos e expor a artéria. Separe o nervo vago da artéria. Isso reduz os efeitos negativos da remoção do nervo vago no metabolismo da glicose.
    NOTA: O passo da incisão ventral até o passo onde o cateter é inserido na veia e fixado com suturas de seda é realizado sob um microscópio.
  4. Coloque duas suturas de seda sob a artéria. Interromper o fluxo sanguíneo amarrando uma sutura firmemente no lado cranial (Figura 2C-1) e a outra frouxamente no lado caudal (Figura 2C-2), o que é suficiente para interromper o fluxo sanguíneo, mas o suficiente para abrir novamente mais tarde. Colocar mais um ponto sob a artéria (Figura 2C-3).
  5. Cortar a artéria próxima à Figura 2C-1 com tesoura de mola e colocar tubulação1.3 na artéria. Faça uma amarração solta tanto na artéria quanto na tubulação (Figura 2C-3, não amarre firmemente. A tubulação será inserida mais profundamente na artéria). Abra o nó do lado caudal (Figura 2C-2) para inserir o tubo até que a marca de 9 mm atinja o nó no meio (Figura 2C-3). Amarre firmemente todas as ligaduras e lave com soro fisiológico estéril heparinizado.
  6. Expor a veia jugular direita da mesma incisão da artéria carótida direita para o cateter jugular. Isolar a extremidade cranial e ligá-la com fio de seda (Figura 2D-1, Tabela de Materiais). Colocar outro pedaço de sutura na extremidade caudal da veia exposta (Figura 2D-2). Corte a veia próxima à marca Figura 2D-1 com tesoura de mola.
  7. Insira o cateter (não muito profundo para evitar a penetração de vasos), amarre-o e confirme visualmente que ele coleta sangue. Lave com soro fisiológico estéril heparinizado (0,2 mL) e confirme visualmente que não há sangue no cateter.
  8. Coloque o rato sobre o novo pano cirúrgico estéril para evitar a infecção da primeira ferida. Vire o mouse, limpe com três ciclos de betadina seguido de uma preparação pré-operatória com álcool estéril e faça uma pequena incisão entre as omoplatas.
  9. Passe um porta-agulhas sob a pele da incisão nas costas para o lado ventral. Aperte os cateteres com o suporte da agulha, passe-os sob a pele e traga-os de volta. Limpar o local da incisão e fechar as incisões ventrais com uma sutura sintética (diâmetro 0,15-0,2 mm). Aperte o cateter venoso com micro serrefine no local da incisão entre as omoplatas.
  10. Cortar o cateter 1 cm acima da pinça, lavá-lo com soro fisiológico heparinizado e fechá-lo com uma tampa (passo 2.4). Siga o mesmo procedimento para o cateter arterial. Fechar a incisão dorsal com sutura sintética (diâmetro 0,15-0,2 mm).
  11. Coloque o mouse em uma gaiola quente e limpa (Figura 2E). Realizar cuidados pós-operatórios diariamente.

3. Recuperação

  1. Único abrigar o mouse porque outro camundongo pode morder o cateter na habitação do grupo.
    1. Para reduzir o estresse pelo isolamento social, mantenha ratos com enriquecimento ambiental (por exemplo, abrigos). Realizar cuidados pós-operatórios diariamente. Para aliviar a dor, angústia e desconforto, fornecer cuidados pós-operatórios, incluindo analgesia (ibuprofeno em água potável (0,11 mg/mL).
    2. Observe os ratos em busca de sinais de infecção, como festering, letargia ou dor no local da incisão. A maioria dos ratos saudáveis começa a andar e se alimentar cerca de 2 h após a cirurgia. Uma postura curvada, pelos babados e diminuição da ingestão de alimentos podem indicar dor. Se esses sinais forem observados, eutanasiar imediatamente os camundongos, decapitando-os sob anestesia profunda ou asfixia por dióxido de carbono.
  2. O sangue entrará no cateter na artéria e formará um coágulo. Para manter as linhas de cateter, remova o coágulo diariamente, seguindo os passos 3-6.
  3. Encher uma seringa de 1 mL e uma agulha 23 G (extremidade não afiada) com soro fisiológico heparinizado (100 U/mL). Com uma câmara de indução, anestesiar levemente o camundongo com isoflurano (1,0%-1,5%). Em seguida, remova o camundongo da câmara e realize a remoção do coágulo sob anestesia com isoflurano com uma tampa nasal.
  4. Aperte a tubulação para a artéria na parte de trás do rato com micro serrefine, remova a tampa e extraia o sangue e os coágulos. Lavar o cateter com soro fisiológico heparinizado usando outra seringa de 1 mL com uma agulha 23 G (extremidade não afiada) e reencapá-lo. Limpe a linha venosa como a linha arterial no caso de coagulação grave.
  5. Faça o mesmo procedimento para limpar o cateter uma vez por dia durante 3-5 dias.
  6. Verifique o peso corporal do mouse. Se o peso corporal reduzir em mais de 10% a partir do dia da cirurgia, aplique cuidados de suporte e tente melhorar a pontuação de condição corporal normal e use o mouse para outro experimento.
    OBS: A perda de peso dos animais foi inferior a 10% nos experimentos deste estudo. A perda de peso afetará fortemente o metabolismo sistêmico da glicose. Assim, recomenda-se aguardar a recuperação do peso corporal ou retirar do experimento de grampos.

4. Configure o sistema de bomba (para braçadeira hipoglicemiante)

  1. Preparar 1 U/mL de insulina em solução salina BSA 0,1%, glicose a 30% em solução salina e solução salina heparinizada.
  2. Meça o peso corporal do rato. Calcular o volume de 1 U/mL de insulina para fazer o infusato de insulina (10 mU/kg/min). Infundir 1,7 μL/min de solução de insulina nos ratos no experimento de clamp. Para produzir 300 μL de infusato de insulina, o volume necessário para 1 U/mL de insulina (μL) é de 2,647 (μL/g) x Peso corporal (g). Um volume de 300 μL de infusato de insulina é suficiente para terminar o experimento de pinça em 1 camundongo. A Tabela 1 mostra um exemplo de fabricação de infusato de insulina.
  3. Preencher infusato de insulina e glicose a 30% em cada seringa de Hamilton, conectá-los com a tubulação 1.2 e colocar a seringa na bomba de seringa (Figura 3A). Encher cada solução em tubagem 1.2. Encher o soro fisiológico em uma seringa de 1 mL e conjunto de tubos 1.4 (Figura 2A).
  4. Anestesiar o camundongo com isoflurano (1,0%-1,5%) e conectar tubing1.2 ao cateter venoso e conjunto de tubing1.4 ao cateter arterial (Figura 3A). Use fita celofane, para manter os tubos juntos.
  5. Coloque o rato num copo vazio de 500 ml.
    NOTA: Para grampo hiperglicêmico, use soro fisiológico em vez de 1 U/mL de insulina.

5. Grampo hipoglicemiante

  1. Medir os níveis de glicose no sangue a cada 5-10 min, como mostrado na Figura 3B, e coletar amostras de sangue para dosagens hormonais em -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min e 120 min. Siga o passo 5.2 para medir a glicemia.
    NOTA: Não é necessário medir a glicemia em todos os momentos, mas recomenda-se medi-la pelo menos a cada 10 min. Medir a glicemia a cada 5 minutos quando seu nível e taxa de infusão de glicose não estiverem estáveis.
  2. Aperte a extremidade superior do conjunto de tubos1.4 e conecte uma nova seringa, extraia 50 μL de sangue e coloque-a em um tubo de 1,5 mL para lavagem. Medir o nível de glicose no sangue.
    NOTA: Este é o sangue diluído pela solução salina no tubo devido à lavagem do cateter após a amostragem anterior. Um volume de 50 μL é suficiente para substituir o sangue diluído por sangue puro.
  3. Armazenar o sangue diluído (glóbulos vermelhos). Lave o sangue acumulado (~500 μL) com soro fisiológico (ver passos 5.11-5.12) e regresse ao corpo para prevenir a hipóxia.
  4. O cateter é conectado à artéria com pressão alta, portanto, quando a pinça é solta, o sangue fluirá para fora e será usado para medir a glicose com um medidor de glicose útil. Infundir 50 μL de soro fisiológico para manter quantidade suficiente de fluido sanguíneo.
  5. Para a amostragem de sangue, extrair mais 50 μL de sangue e colocá-lo em um tubo de 1,5 mL sobre gelo. Infundir 100 μL (50 μL de reposição + 50 μL de amostragem) de solução salina.
  6. Após 0 min da medição da glicemia, inicie a bomba da seringa de insulina. Primeiro, infundir 30 mU/kg/min em bolus por 2 min (5,1 μL/min), depois infusão de 10 mU/kg/min (1,7 μL/min) pelo restante da duração.
  7. Medir o nível de glicose no sangue e alterar a taxa de infusão de glicose a cada 5-10 min por 120 min.
  8. Criar um estado estacionário onde a taxa de infusão de glicose não muda, e o nível de glicose no sangue é de 50 mg/dL.
  9. Após a coleta da amostra de sangue em t = 120 min, infundir um agente de eutanásia na veia jugular e coletar tecidos para análise de RNA ou proteína.
  10. Centrifugar o sangue a 1000 x g por 5 min e medir a concentração de hormônios como insulina ou peptídeo c usando um kit ELISA de acordo com o protocolo do fabricante.
  11. Para lavar o sangue, centrifugar o sangue a 1000 x g por 3 min. Retire o sobrenadante, adicione 500 μL de solução salina heparinizada e realize a pipetagem.
  12. Repita a lavagem novamente e coloque as hemácias lavadas em seringa de 1 mL para a artéria. As células sanguíneas serão reinfundidas automaticamente quando 50 ou 100 μL de solução salina forem infundidos nas etapas 5.2 e 5.3. Monitore o hematócrito cuidadosamente para evitar hipóxia.
    OBS: Para a dosagem da glicemia, foi utilizado um glicosímetro comercial manual.

6. Grampo hiperglicêmico

  1. Seguir os passos como a técnica de clamp hipoglicêmico, porém sem infusão de insulina e com glicemia ajustada para 250-300 mg/dL. Medir os níveis de glicose no sangue a cada 5-10 min, como mostrado na Figura 3B, e coletar amostras de sangue para dosagens hormonais em -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min e 120 min.
  2. Ligar uma nova seringa ao conjunto de tubos1.4, extrair 50 μL de sangue e colocá-la num tubo de 1,5 ml para lavagem.
  3. Para a amostragem de sangue, extrair mais 50 μL de sangue e colocá-lo em um tubo de 1,5 mL sobre gelo. Infundir 100 μL (50 μL de reposição + 50 μL de amostragem) de solução salina.
  4. Após 0 min da medição da glicemia, inicie a bomba da seringa de glicose. Primeiro, infundir 30 g/kg/min em bolus por 2 min (5,1 μL/min), depois 10 g/kg/min (1,7 μL/min) pelo resto da duração.
  5. Medir o nível de glicose no sangue e alterar a taxa de infusão de glicose a cada 5 -10 min por 120 min. Criar um estado estacionário onde a taxa de infusão de glicose não muda, e o nível de glicose no sangue é de 250-300 mg/dL, um estado hiperglicêmico clampeado.

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Representative Results

O estudo do clamp hipoglicemiante foi realizado em camundongos machos C57BL/6N (8 semanas de idade, mais de 25 g PV) 3 h em jejum no início do experimento (Figura 4A,B). A glicemia inicial era de 136 mg/dL (t = -15 min). Se for inferior a 90 mg/dL, pode ser porque a cirurgia não correu bem, ou o cateter arterial foi inserido muito fundo, ou coágulos sanguíneos entraram no fluxo sanguíneo. A condição do rato após a cirurgia afeta o metabolismo energético no rato. O metabolismo fisiológico da glicose não pode ser medido em condições precárias de saúde. C57BL é mais propenso à coagulação após a cirurgia; camundongos que têm um peso corporal mais alto, como camundongos FVB ou ICR, são menos propensos a perder peso devido à lavagem de coágulos após a cirurgia. Assim, é melhor para iniciantes usar ratos FVB para praticar procedimentos de grampo. Camundongos C57BL requerem cuidados mais intensivos. A inserção do cateter de 9 mm na artéria não nos deu nenhum problema na coleta de sangue, mesmo em camundongos FVB e ICR. A insulina foi iniciada em t = 0 min, e os níveis de glicose sanguínea diminuíram (Figura 4A). O GIR não se manteve estável entre t = 0 min e t = 70 min. Posteriormente, tornou-se um estado estacionário após 80 min.

O estudo do clamp hiperglicêmico também foi realizado em camundongos machos C57BL/6N (8 semanas de idade, mais de 25 g peso vivo) em jejum de 3 h no início do experimento (Figura 4C,D). Após a mensuração da glicemia e coleta de amostras de sangue em t = -15 e t = -5 min, a glicose foi infundida de t = 0 min. A glicemia passou a ser de 250 mg/dL em t = 40 min. O estado estacionário continuou de t = 30 min até o final.

Figure 1
Figura 1: Regulação dos níveis glicêmicos. (A) Diagrama conceitual ilustrando a regulação da glicose no sangue no corpo. (B,C) Regulação do metabolismo da glicose no (B) teste de tolerância à glicose (GTT) e (C) teste de tolerância à insulina (ITT). Vários fatores regulam os níveis de glicose no sangue. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparo das tubulações e etapas da cirurgia. (A) Imagens de tubos para artéria carótida e veia jugular. Os números de tubulação correspondem aos números da etapa do protocolo. (B) Método de preparo das tubulações para a cirurgia. (C, D) As posições numeradas onde os fios de seda são ligados para inserir o cateter na artéria (C) e na veia (D). Posições dos fios de seda nas faces cranial (C-(1)) e caudal da artéria (C-(2)), e mais uma no meio delas (C-(3)) (procedimento 2-4). Posições dos fios de seda nas faces cranial (D-(1)) e caudal da veia (D-(2)), e mais uma no meio delas (D-(3)) (procedimento 2-6). (E) Diagrama das cânulas arteriais e venosas saindo do dorso Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Ajuste da braçadeira (A) Diagrama mostrando a configuração de tubulações, bombas, seringas e mouse. (B) Folha para registro dos níveis de glicose no sangue e taxa de infusão de glicose. 50 μL de sangue são coletados em t = -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min e 120 min. A velocidade de infusão de insulina foi de 5,1 μL/min de t = 0 a 2 min e alterada para 1,7 em t = 2 min. A glicemia foi medida a cada 10 min. A glicemia foi medida a cada 5 min quando seu nível não estava estável. A taxa de infusão de glicose foi alterada a cada medida da glicemia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados representativos do clamp hipoglicêmico e do clamp hiperglicêmico. (A) Níveis de glicose no sangue e (B) Taxa de infusão de glicose de clamp hipoglicêmico. (C) Níveis glicêmicos e (D) Taxa de infusão de glicose do clamp hiperglicêmico. Os dados representam a média ± MEV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Solução Cálculo Para 20 g de rato
1 U/mL de insulina (2,647 x peso corporal) μL 52,9 μL
Solução salina BSA a 0,1% 300 μL - volume de insulina (μL) 247,1 μL

Tabela 1: Um exemplo de cálculo para o preparo do infusato de insulina.

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Discussion

O método descrito aqui é simples e pode ser feito com pontas de pipetas, seringas e outros itens encontrados em laboratórios comuns. Embora os pesquisadores possam precisar comprar tubos e bombas adicionais, equipamentos caros não são necessários. Assim, esse protocolo de cateterismo e pinçamento é mais fácil de iniciar em comparação com relatos prévios 12,13,14.

A técnica de pinça foi desenvolvida por volta de 1970 e tem sido utilizada em camundongos e humanos15. É um método útil para medir com precisão o metabolismo da glicose e é dito ser o padrão-ouro. No entanto, não é uma técnica comum utilizada por muitos pesquisadores. A técnica de clamp euglicêmico-hiperinsulinêmico foi relatada em camundongos13 e ratos14, mas o método de cateterismo aqui é diferente, e os leitores podem escolher o mais fácil para seus experimentos. Um dos objetivos deste artigo é reduzir o obstáculo para iniciar um experimento. Portanto, fornecemos informações detalhadas sobre os materiais de cateteres artesanais, procedimentos cirúrgicos e um exemplo de curso temporal experimental. Estes são informativos para o pesquisador que tenta realizar o clamp na primeira vez.

A secreção de insulina na obesidade e no diabetes é estágio-dependente. Muitos relatos sugerem que a secreção de insulina está aumentada na obesidade para reduzir a glicemia no estado resistente à insulina16, mas a função das células β estará prejudicada no DM tipo 217,18. De fato, o número e a área das ilhotas pancreáticas e a secreção de insulina têm sido relatados como aumentados em modelos de camundongos com obesidade, como camundongos alimentados com dieta rica em gordura19 ou camundongos deficientes em leptina20. Nesses modelos de camundongos, que têm um fenótipo óbvio, as diferenças podem ser determinadas examinando os níveis de insulina no sangue 15-30 minutos após a administração de glicose no GTT. No entanto, em alguns casos, não é fácil determinar as diferenças na secreção de insulina. Por exemplo, se camundongos transgênicos (Tg) têm um nível de glicose no sangue de 500 mg/dL, enquanto um camundongo WT tem 300 mg/dL e ambos os camundongos têm o mesmo nível de insulina no sangue, podemos dizer que a secreção de insulina diminui em Tg? Neste caso, não podemos comparar a capacidade de secreção de insulina a menos que os níveis de glicose no sangue sejam os mesmos usando o método aqui introduzido. Esta é uma das razões pelas quais não há uma teoria estabelecida sobre quando a função das células β começa a se deteriorar na transição da obesidade para o diabetes. Também podemos medir a secreção de insulina por cultura primária dopâncreas21 ou ex vivo22. No entanto, irá arruinar o efeito do sistema nervoso central na liberação de insulina, porque a inervação do nervo vago será removida. A secreção de insulina pós-absorção é bem conhecida, mas o cérebro e o sistema nervoso autônomo também regulam a liberação de insulina23. O experimento para análise desta última deve ser realizado em uma coleta de sangue não anestesiada, irrestrita e indolor. É também por isso que o nervo vago deve ser separado da artéria carótida no passo 2.3.

Tem sido relatado que o diabetes mellitus causa hiperglicemia devido à resistência à insulina e aumento da secreção de glucagon24 e outros hormônios contrarreguladores25. Além disso, episódios repetidos de hipoglicemia em humanos com diabetes devido a falhas na dosagem de insulina ou outras causas podem levar a uma condição denominada hipoglicemia recorrente, na qual os pacientes são propensos à hipoglicemia26. Tem sido sugerido que a taxa de queda da glicemia no clamp hipoglicêmico afeta a detecção periférica ou central da hipoglicemia27. A hipoglicemia de início lento pode ser apropriada para estudar o papel dos sensores de glicose nas veias porta-mesentéricas, enquanto uma diminuição muito rápida da glicemia pode ser para o estudo de sensores de glicose cerebrais27. 1 U/mL de insulina é usada em camundongos C57BL magros. Mas, uma maior concentração de insulina será necessária em camundongos obesos porque eles têm resistência à insulina, e 1 U/mL não é suficiente para diminuir os níveis de glicose no sangue.

No modelo unicompartimental do pool glicêmico (Figura 1A), a quantidade de glicose absorvida pode afetar a taxa de entrada de glicose14. Assim, a taxa de produção de glicose, um dos principais objetivos da medida do clamp euglicêmico-hiperinsulinêmico, pode ser afetada pelo tempo de jejum. No entanto, o longo tempo de jejum pode aumentar a liberação de hormônios contrarreguladores. Assim, os pesquisadores estabeleceram o tempo de jejum de acordo com seu objetivo de análise. Outro método de clamp inclui a coleta de sangue da cauda, que é simples, pois apenas uma cânula intravenosa precisa ser inserida14. No entanto, o sangue é coletado em uma contenção, o que causa uma quantidade moderada de estresse de contenção e um aumento das catecolaminas plasmáticas e outros hormônios do estresse14. Além disso, é preferível medir as concentrações hormonais no fluxo sanguíneo no centro do corpo do que no sangue nas extremidades. Portanto, a amostragem de sangue das artérias em camundongos em movimento livre é a melhor para medir o metabolismo da glicose fisiologicamente. Os ratos não se movimentam, e o giro não é necessário quando eles são aclimatados ao ambiente experimental. No entanto, recomenda-se o uso de um giro para evitar o emaranhamento de infusão e linhas de amostragem. Tubing1.2 e tubing set1.4 (Figura 3A) não são bons para usar um giratório. O sistema deve ser melhorado se o pesquisador for obrigado a usar um giro. A reinfusão de células sanguíneas não influencia o estado estacionário estabelecido de glicose e insulina no sangue. O presente método também pode ser aplicado a estudos metabolômicos utilizando isótopos. Por exemplo, se 13C-glicose é continuamente infundido na veia, a taxa de turnover metabólico sistêmico e metabólitos intermediários intracelulares podem ser medidos28. Assim, este é um método útil para analisar o metabolismo da glicose.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Leading Initiative for Excellent Young Researchers (do MEXT); uma Bolsa de Auxílio à Pesquisa Científica (B) (Número de Bolsa JP21H02352); Agência Japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (AMED-RPIME, Número de Concessão JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); a Fundação Memorial Uehara; Fundação Astellas de Pesquisa em Distúrbios Metabólicos; Suzuken Memorial Foundation, Akiyama Life Science Foundation e Narishige Neuroscience Research Foundation. Agradecemos também a Nur Farehan Asgar, Ph.D, pela edição de um rascunho deste manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive glue Henkel AG & Co. KGaA LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide) Morinaga Institute of Bilogical Science Inc M1304 Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 633-03411 LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter Nipro Co. 11-777 Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml) Eli Lilly & Co. 428021014 Humulin R (100U/ml)
Mouse Japan SLC Inc. C57BL/6NCrSlc C57BL
Suture Natsume seisakusho C-23S-560 No.2 Sterilized
Syringe Pump Pump Systems Inc. NE-1000
Synthetic suture VÖMEL HR-17
Tubing1 AS ONE Corporation 9-869-01 LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2 Fisher Scientific 427400 BD Intramedic PE Tubing
Tubing3 IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. size5 Polyethylene tubing size5

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References

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Medicina Edição 203
Clamp hiperglicêmico e grampo hipoglicêmico em camundongos conscientes
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