Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מהדק היפרגליקמי ומהדק היפוגליקמי בעכברים מודעים

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65581
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

Summary

מהדק היפרגליקמי משמש למדידת שחרור אינסולין עם ריכוז גלוקוז גבוה יותר בדם. מהדק היפוגליקמי מיועד למדידת ייצור גלוקוז המושרה על ידי תגובות נגד ויסות. שתי השיטות משתמשות באותו הליך כירורגי. כאן, אנו מציגים טכניקת מהדק להערכת מטבוליזם גלוקוז מערכתי.

Abstract

סוכרת (DM) נגרמת על ידי שחרור אינסולין לא מספיק מתאי β הלבלב (סוג 1 DM) ורגישות לאינסולין בשרירים, בכבד וברקמות השומן (סוג 2 DM). הזרקת אינסולין מטפלת בחולי DM אך מובילה להיפוגליקמיה כתופעת לוואי. קורטיזול וקטכולאמינים משתחררים כדי להפעיל את ייצור הגלוקוז מהכבד כדי לשחזר היפוגליקמיה, הנקראת תגובות נגד ויסות (CRR). במחקר DM באמצעות מודלים של מכרסמים, בדיקות סבילות לגלוקוז והזרקת 2-דאוקסי-גלוקוז משמשות למדידת שחרור אינסולין ו-CRR, בהתאמה. עם זאת, ריכוזי הגלוקוז בדם משתנים באופן מתמשך במהלך ניסויים, מה שגורם לקשיים בהערכת שחרור אינסולין נטו ו- CRR. מאמר זה מתאר שיטה שבה גלוקוז בדם נשמר על 250 מ"ג / ד"ל או 50 מ"ג / ד"ל בעכברים מודעים כדי להשוות את שחרור הורמוני אינסולין ו- CRR, בהתאמה.

צינורות פוליאתילן מושתלים בעורק התרדמה ובווריד הצוואר של העכברים, והעכברים מורשים להתאושש מהניתוח. צינור הוורידים הצווארי מחובר למזרק המילטון עם משאבת מזרק כדי לאפשר עירוי אינסולין או גלוקוז בקצב קבוע ומשתנה. צינורות עורק התרדמה מיועדים לאיסוף דם. עבור מהדק היפרגליקמי, 30% גלוקוז הוא חדורים לתוך הווריד, ואת רמות הגלוקוז בדם נמדדים מן הדם העורקי כל 5 דקות או 10 דקות. שיעור העירוי של 30% גלוקוז מוגבר עד רמת הגלוקוז בדם הופך 250 מ"ג / ד"ל. הדם נאסף כדי למדוד את ריכוזי האינסולין. עבור מהדק היפוגליקמי, אינסולין של 10 mU / kg / min מוחדר יחד עם 30% גלוקוז, ששיעור העירוי שלו משתנה כדי לשמור על 50 מ"ג / ד"ל של רמת הגלוקוז בדם. הדם נאסף כדי למדוד הורמונים נגד ויסות כאשר גם עירוי גלוקוז וגם גלוקוז בדם מגיעים למצב יציב. גם מלחציים היפרגליקמיים וגם מהדקים היפוגליקמיים יש את אותו הליך כירורגי ומערך ניסיוני. לפיכך, שיטה זו שימושית עבור חוקרים של מטבוליזם גלוקוז מערכתי.

Introduction

גלוקוז הוא מקור אנרגיה חשוב לתאים, ומחסור בגלוקוז יכול להוביל למגוון תסמינים וסיבוכים. במקרה של גלוקוז נמוך (היפוגליקמיה, בדרך כלל פחות מ 70 מ"ג / ד"ל ברמת גלוקוז בדם בצום, אבל לא צריך להיקבע על ידי ערך יחיד1), הסימפטומים הנפוצים ביותר כוללים חולשה, בלבול, הזעה, וכאבי ראש. זה יכול גם לשבש את תפקוד המוח ולהגדיל את הסיכון לאירועים קרדיווסקולריים ותמותה2. לעומת זאת, היפרגליקמיה היא מצב רפואי שבו ריכוז הגלוקוז בפלזמה עולה על רמות נורמליות (בדרך כלל > 126 מ"ג / ד"ל ברמת גלוקוז בדם בצוםרמה 3). זה יכול להתרחש אצל אנשים עם סוכרת שיש להם או גירעון בייצור אינסולין או ניצול. היפרגליקמיה עלולה להוביל לחמצת קטוטית סוכרתית, המתרחשת כאשר הגוף אינו יכול להשתמש בגלוקוז לאנרגיה אלא במקום זאת מפרק חומצות שומן לדלק. המצב היפרגליקמי היפראוסמולרי גם מגביר תמותה4. היפרגליקמיה ארוכת טווח עלולה לגרום נזק לכלי דם, עצבים ואיברים, מה שמוביל להתפתחות של מספר סיבוכים כרוניים כגון מחלות לב וכלי דם, רטינופתיות ומחלות כליות. לכן, ריכוז הגלוקוז בדם חייב להישמר בטווח הדוק בין 100 מ"ג / ד"ל ו 120 מ"ג / ד"ל.

רמת הגלוקוז בדם מווסתת על-ידי האיזון בין קלט ופלט הגלוקוז במודל של תא אחד (איור 1A). קלט גלוקוז כולל גלוקוז נספג ממזון וייצור גלוקוז מהכבד, הכליות והמעי הדק. תפוקת הגלוקוז כוללת ספיגת גלוקוז ברקמות וסילוק גלוקוז מהכליות. הן כמות הקלט והפלט של גלוקוז מוסדרים על ידי הורמונים אנדוקריניים. לדוגמה, גלוקגון, קורטיקוסטרון וקטכולאמינים, הידועים כהורמונים נגד ויסות, משתחררים כאשר רמות הגלוקוז בדם יורדות5. הם מעוררים את התמוטטות הגליקוגן ואת הסינתזה של גלוקוז, בעיקר מן הכבד; תהליכים אלה ידועים בשם glycogenolysis ו gluconeogenesis, בהתאמה. היפרגליקמיה מגבירה את שחרור האינסולין מתאי β הלבלב ומעוררת ספיגת גלוקוז בשרירים, ברקמות השומן ובלב 6,7,8,9. פעילות גופנית מגבירה את ספיגת הגלוקוז שאינה תלויה באינסולין10. מערכת העצבים הסימפתטית מגבירה את ספיגת הגלוקוז בשרירים וברקמת השומן החומה 6,11. כדי למדוד את היכולת לווסת את חילוף החומרים של גלוקוז ברקמות היקפיות, חוקרים בדרך כלל משתמשים במבחן סבילות לגלוקוז (GTT) ובמבחן סבילות לאינסולין (ITT) (איור 1B,C). ב-GTT יש לקחת בחשבון שני גורמים: שחרור אינסולין ורגישות לאינסולין (איור 1B). עם זאת, עקומת ריכוז הגלוקוז במהלך הבדיקה של 120 דקות שונה בכל עכבר, מה שעשוי להשפיע על כמויות שונות של שחרור הורמונים. ב- ITT, גלוקוז בדם מווסת הן על ידי רגישות לאינסולין והן על ידי שחרור הורמונים נגד ויסות. לכן, קשה לקבוע את המשמעות המדויקת של חילוף החומרים של גלוקוז, שחרור אינסולין ורגישות לאינסולין ב- GTT ו- ITT, במצבים בהם רמות הגלוקוז בדם אינן קבועות.

כדי להתגבר על בעיות אלה, רצוי לשמור על רמת הגלוקוז בדם ברמה קבועה (או "מהדק"). במהדק היפרגליקמי, גלוקוז מוחדר לזרם הדם כדי להעלות את רמות הגלוקוז בדם לרמה מסוימת ולאחר מכן נשמר ברמה זו למשך תקופה של זמן. כמות הגלוקוז המוחדרת מותאמת על סמך מדידות של רמות הגלוקוז בדם כל 5-10 דקות כדי לשמור על מצב יציב. טכניקה זו שימושית במיוחד להבנת הפרמטרים של הפרשת אינסולין ברמת גלוקוז מהודקת. מהדק היפוגליקמי היא שיטה לשמירה על רמות גלוקוז נמוכות בדם על ידי עירוי אינסולין. גלוקוז הוא חדורים בקצב משתנה כדי לשמור על רמת גלוקוז ספציפית בדם. אם העכבר לא יכול להתאושש היפוגליקמיה, יותר גלוקוז צריך להיות חדורים.

למרות שישנם יתרונות רבים לביצוע מלחציים היפרגליקמיים והיפוגליקמיים, ההליכים הכירורגיים והניסיוניים נחשבים קשים מבחינה טכנית. לכן, קבוצות מחקר מעטות הצליחו לעשות זאת. מטרתנו הייתה לתאר שיטות אלה עבור חוקרים עם אילוצים פיננסיים וכוח אדם להתחיל ניסויים אלה בתקציב נמוך יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קומאמוטו.

הערה: להקלה על כאבים, איבופרופן ניתן במי שתייה (0.11 מ"ג / מ"ל) במשך 48 שעות, ובופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג i.p.) ניתן 30 דקות לפני הניתוח. התנאים הסטריליים כוללים כפפות, מסכות ומכשירים אוטוקלאביים מעוקרים עם אתילן אוקסיד בין בעלי חיים. הניתוח בוצע על כרית חימום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וכוסה בשטיחון מעבדה חדש לכל חיה. לפני הניתוח נוקה אזור הניתוח בתמיסת בטאדין ואלכוהול. כל כלי הניתוח עוקרו עם אוטוקלאבה (לא יותר משני ניתוחים). לפני ביצוע החתך, נבדקו עכברים כדי לוודא שהם מורדמים באופן מלא. עומק ההרדמה של כל עכבר הוערך לפני ובמהלך הניתוח על ידי צביטת בוהן. תקופת ההתאקלמות הייתה לא יותר מ 5 דקות בכל פעם. בצע את ההוראות של IACUC במוסד המתאים.

1. הכנת צינורות לווריד הצוואר ועורק התרדמה

  1. יש לעקר את כל הצינורות, חומרי הפוליפרופילן (למשל, קצות הצינורות) והתפרים באמצעות אוטוקלאבה או אתילן אוקסיד. עבור הווריד הצווארי, חברו 8 ס"מ של צינורות1 (ראו חומרים) ו-3 ס"מ של צינורות2 באמצעות דבק (איור 2A). שים 2 מ"מ של אבובים1 על החלק העליון כי צינורות 2 (פוליאתילן) קשה מדי ועלול לפגוע בכלי הדם (Tubing1.1).
  2. צינור הארכה לווריד הצוואר (Tubing1.2) להחדרת גלוקוז ואינסולין
    1. הכינו שני צינורות בקוטר 30 ס"מ וצינור אחד בקוטר 10 ס"מ עם אבובים2 (איור 2A). חותכים את הקצה החד של קצה פיפטה 20 μL (או כל דבר שיש לו קצה צר עם OD < 0.5 מ"מ לחיבור עם צינורות 1.1) ומניחים בו שלושה צינורות 2 (30 ס"מ, 30 ס"מ ו-10 ס"מ). חותמים בדבק דבק.
    2. מניחים 5 ס"מ של אבובים1 בקצה השני של הצינור2.
  3. לעורק התרדמה (אבובינג1.3): יש למתוח את הצינור2 כדי להפוך אותו לדק יותר. חברו 8 ס"מ של צינור1 ו-3 ס"מ של הצינור המתוח2 באמצעות דבק (איור 2A). יש לסמן בקוטר 9 מ"מ מהקצה.
  4. מחט עם קצה לא חד שמחברת את הצינור למזרק: יוצרים שריטה ליד הקצה החד של המחט (23 גרם) עם קובץ מתכת, מכופפים אותה בעדינות קדימה ואחורה כמה פעמים עם צבת, ושוברים אותה. בצעו את אותו חיתוך באמצע המחט כדי ליצור חתיכת מחבר מתכת (איור 2A).
  5. צינור מאריך לעורק לשאיבת דם (סט צינורות 1.4): חבר 10 ס"מ של צינור1 עם מחבר המתכת והמחט הלא חדה שנעשתה בשלב 1.4.
    הערה: כל הצינורות והתפרים מעוקרים עם אוטוקלאבה או אתילן אוקסיד

2. ניתוח

  1. להרדים עכבר עם איזופלורן (1.5-2.0%) או קטמין/קסילזין (קטמין 10 מ"ג/מ"ל, קסילזין 1 מ"ג/מ"ל במי מלח סטריליים 0.9%, 0.1 מ"ל/10 גרם משקל גוף (BW) באמצעות הזרקה תוך צפקית [ip]). שמור את העכבר על כרית חמה (37 ° C) כדי להפחית את הלחץ הפיזי. יש להמתין להרדמה עמוקה למשך 5-10 דקות. אשר את עומק ההרדמה על ידי רפלקס הדוושה, הנשימה וקצב הלב, ותגובה לגירויים על ידי צביטת בוהן. במהלך הניתוח, יש להשתמש בסרט כירורגי כדי להצמיד את כובע האף לשולחן הניתוחים לשאיפה מתמשכת של הרדמה. יש למרוח משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
  2. מלאו מלח הפריני (100 U/mL) בצינורות 1.1 ו-1.3 וחברו אותם למזרק 1 מ"ל עם מחט לא חדה (איור 2B). סגור את קצה הצינור3 (ראה טבלת חומרים) על ידי התכתו במגהץ הלחמה, שישמש כמכסים לאבובים1.1 ואבובים1.3.
  3. יש לגלח ולנגב את אזור החתך הראשון (interscapular מאחור) והשני (צוואר מלפנים) עם שלושה מחזורים של 10% betadine ולאחר מכן הכנה לפני הניתוח עם 70% אלכוהול סטרילי. בצע חתך אנכי קטן בקו האמצע 5 מ"מ עד עצם החזה, נתח את הרקמות בצורה קהה וחשף את העורק. להפריד את העצב התועה מן העורק. זה מקטין את ההשפעות השליליות של הסרת עצב הואגוס על חילוף החומרים גלוקוז.
    הערה: השלב מהחתך הגחוני לשלב בו מוחדר הצנתר לווריד ומאובטח באמצעות תפרי משי מתבצע תחת מיקרוסקופ.
  4. מניחים שני תפרי משי מתחת לעורק. עצרו את זרימת הדם על-ידי קשירת תפר אחד בחוזקה בצד הגולגולתי (איור 2C-1) והשני באופן רופף בצד הקאודלי (איור 2C-2), וזה מספיק כדי לעצור את זרימת הדם אבל מספיק כדי להיפתח שוב מאוחר יותר. הניחו תפר אחד נוסף מתחת לעורק (איור 2C-3).
  5. חתכו את העורק ליד איור 2C-1 בעזרת מספריים קפיציים והכניסו צינורות 1.3 לתוך העורק. צרו קשירה רופפת גם בעורק וגם בצינורית (איור 2C-3, אל תקשרו היטב. הצינורית תוכנס עמוק יותר לתוך העורק). פתחו את הקשר בצד הקאודלי (איור 2C-2) כדי להחדיר את הצינור עד שסימן 9 מ"מ יגיע לקשר באמצע (איור 2C-3). קשרו היטב את כל הליגטורות ושטפו במי מלח סטריליים שעברו הפריניזציה.
  6. חשוף את וריד הצוואר הימני מאותו חתך כמו עורק התרדמה הימני עבור קטטר הצוואר. בודדו את קצה הגולגולת וקשרו אותו בתפר משי (איור 2D-1, טבלת חומרים). הניחו חתיכת תפר נוספת בקצה הקאודלי של הווריד החשוף (איור 2D-2). חתכו את הווריד ליד הסימן איור 2D-1 עם מספריים קפיציים.
  7. הכניסו את הצנתר (לא עמוק מדי כדי למנוע חדירה של כלי דם), קשרו אותו ואשרו ויזואלית שהוא דוגם דם. סומק עם מלוחים סטריליים heparinized (0.2 מ"ל) ולוודא חזותית כי לא נשאר דם בצנתר.
  8. הניחו את העכבר על הווילונות הכירורגיים הסטריליים החדשים כדי למנוע זיהום מהפצע הראשון. הופכים את העכבר, מנגבים עם שלושה מחזורים של בטדין ואחריו הכנה לפני הניתוח עם אלכוהול סטרילי, ולעשות חתך קטן בין השכמות.
  9. מעבירים מחזיק מחט מתחת לעור מהחתך בגב לצד הגחוני. הדקו את הצנתרים עם מחזיק המחט, העבירו אותם מתחת לעור והחזירו אותם. נקו את אתר החתך וסגרו את החתכים הגחונים בתפר סינתטי (קוטר 0.15-0.2 מ"מ). הדקו את הצנתר הוורידי עם מיקרו סרפדיין באזור החתך בין השכמות.
  10. חותכים את הקטטר 1 ס"מ מעל המהדק, לשטוף אותו עם מלוחים heparinized, ולסגור אותו עם מכסה (שלב 2.4). בצע את אותו הליך עבור קטטר עורקי. סגור את החתך הגבי בתפר סינתטי (קוטר 0.15-0.2 מ"מ).
  11. הניחו את העכבר בכלוב חם ונקי (איור 2E). בצע טיפול לאחר הניתוח מדי יום.

3. התאוששות

  1. בית יחיד העכבר כי עכבר אחר עלול לנשוך את הצנתר בבית הקבוצה.
    1. כדי להפחית את הלחץ על ידי בידוד חברתי, החזיקו עכברים עם העשרה סביבתית (למשל, מקלטים). בצע טיפול לאחר הניתוח מדי יום. כדי להקל על כאב, מצוקה ואי נוחות, לספק טיפול לאחר הניתוח, כולל שיכוך כאבים (איבופרופן במי שתייה (0.11 מ"ג / מ"ל).
    2. שימו לב לעכברים לסימנים של זיהום, כגון הדבקה, עייפות או כאב באתר החתך. רוב העכברים הבריאים מתחילים ללכת ולהאכיל כשעתיים לאחר הניתוח. יציבה כפופה, פרווה פרועה וצריכת מזון מופחתת עשויים להצביע על כאב. אם סימנים אלה נצפים, מיד להרדים את העכברים על ידי עריפת ראשיהם תחת הרדמה עמוקה או חנק פחמן דו חמצני.
  2. הדם ייכנס לקטטר בעורק וייצור קריש. כדי לשמור על קווי הצנתר, הסר את הקריש מדי יום, לפי שלבים 3-6.
  3. ממלאים מזרק 1 מ"ל ומחט 23 גרם (קצה לא חד) במי מלח הפרינים (100 U/mL). באמצעות תא אינדוקציה, להרדים את העכבר קלות עם isoflurane (1.0%-1.5%). לאחר מכן, הסר את העכבר מהחדר ובצע הסרת קריש תחת הרדמה isoflurane עם כובע האף.
  4. מהדק את הצינור לעורק על גב העכבר עם מיקרו serrefine, להסיר את הכובע, לחלץ את הדם ואת קרישי הדם. לשטוף את הצנתר עם מלוחים heparinized באמצעות מזרק נוסף 1 מ"ל עם מחט 23 G (קצה לא חד) ולסגור אותו מחדש. נקו את הקו הוורידי כמו קו העורקים במקרה של קרישה קשה.
  5. בצע את אותו הליך כדי לנקות את הצנתר פעם ביום במשך 3-5 ימים.
  6. בדוק את משקל הגוף של העכבר. אם משקל הגוף יורד ביותר מ -10% מיום הניתוח, פנה לטיפול תומך ונסה לשפר את ציון מצב הגוף הרגיל, והשתמש בעכבר לניסוי נוסף.
    הערה: הירידה במשקל של בעלי חיים הייתה פחות מ -10% בניסויים במחקר זה. ירידה במשקל תשפיע מאוד על חילוף החומרים המערכתי של גלוקוז. לכן, מומלץ להמתין להתאוששות משקל הגוף או להסיר מניסוי המהדק.

4. הגדר את מערכת המשאבה (למהדק היפוגליקמי)

  1. הכינו 1 U/mL אינסולין במי מלח 0.1% BSA, 30% גלוקוז במי מלח ומלוחים הפריניזציה.
  2. מדוד את משקל הגוף של העכבר. חשב את נפח האינסולין 1 U/mL כדי לגרום לאינסולין להחדיר (10 mU / kg / min). החדירו 1.7 מיקרוליטר/דקה של תמיסת אינסולין לעכברים בניסוי המהדק. כדי לגרום ל-300 מיקרוליטר אינסולין להחדיר, הנפח הנדרש עבור 1 U/mL אינסולין (μL) הוא 2.647 (μL/g) x משקל גוף (g). נפח של 300 μL של אינסולין להחדיר מספיק כדי לסיים את ניסוי מהדק על עכבר אחד. טבלה 1 מציגה דוגמה להחדרת אינסולין.
  3. מלאו אינפוזיה של אינסולין ו-30% גלוקוז בכל מזרק המילטון, חברו אותם לצינורות 1.2, והניחו את המזרק על משאבת המזרק (איור 3A). מלא כל פתרון בצינורות 1.2. מלאו מי מלח במזרק 1 מ"ל ובערכת צינורות 1.4 (איור 2A).
  4. מרדימים את העכבר עם איזופלורן (1.0%-1.5%) ומחברים צינורית 1.2 לצנתר ורידי וצינורית 1.4 לצנתר העורקי (איור 3A). השתמש בסרט צלופן כדי להחזיק את הצינורות יחד.
  5. הניחו את העכבר בכד ריק של 500 מ"ל.
    הערה: עבור מהדק היפרגליקמי, השתמש במי מלח במקום 1 U/mL אינסולין.

5. מהדק היפוגליקמי

  1. מדדו את רמות הגלוקוז בדם כל 5-10 דקות, כפי שמוצג באיור 3B, ואספו דגימות דם למדידות הורמונים ב-15- דקות, 10 דקות, 20 דקות, 40 דקות, 60 דקות, 80 דקות, 100 דקות ו-120 דקות. בצע את שלב 5.2 כדי למדוד גלוקוז בדם.
    הערה: אין צורך למדוד גלוקוז בדם בכל נקודות זמן, אבל מומלץ למדוד את זה לפחות כל 10 דקות. למדוד גלוקוז בדם כל 5 דקות כאשר רמתו וקצב עירוי הגלוקוז אינם יציבים.
  2. מהדקים את הקצה העליון של סט הצינורות1.4 ומחברים מזרק חדש, מוציאים 50 מיקרוליטר דם ומניחים אותו בצינור 1.5 מ"ל לשטיפה. למדוד את רמת הגלוקוז בדם.
    הערה: זהו הדם המדולל על ידי תמיסת המלח בצינור בגלל שטיפת קטטר לאחר הדגימה הקודמת. נפח של 50 μL מספיק כדי להחליף דם מדולל בדם טהור.
  3. לאחסן את הדם המדולל (תאי דם אדומים). לשטוף את הדם המצטבר (~ 500 μL) עם מלוחים (ראה שלבים 5.11-5.12) ולחזור לגוף כדי למנוע היפוקסיה.
  4. הצנתר מחובר לעורק בלחץ דם גבוה, כך שכאשר המהדק משתחרר, הדם יזרום החוצה וישמש למדידת גלוקוז עם מד גלוקוז שימושי. להחדיר 50 μL של מלוחים כדי לשמור על כמות מספקת של נוזל הדם.
  5. לדגימת דם, לחלץ 50 μL נוספים של דם ומניחים אותו בתוך צינור 1.5 מ"ל על קרח. להחדיר 100 μL (50 μL של החלפה + 50 μL של דגימה) של מלוחים.
  6. לאחר 0 דקות של מדידת גלוקוז בדם, הפעל את משאבת מזרק האינסולין. ראשית, להחדיר 30 mU / kg / min בולוס במשך 2 דקות (5.1 μL / min), ולאחר מכן 10 mU / kg / min (1.7 μL / min) עירוי למשך שארית הזמן.
  7. למדוד את רמת הגלוקוז בדם ולשנות את קצב עירוי גלוקוז כל 5-10 דקות במשך 120 דקות.
  8. צור מצב יציב שבו קצב עירוי הגלוקוז אינו משתנה, ורמת הגלוקוז בדם היא 50 מ"ג / ד"ל.
  9. לאחר איסוף דגימת הדם ב t = 120 דקות, להחדיר סוכן המתת חסד לתוך הווריד jugular ולאסוף רקמות עבור RNA או ניתוח חלבון.
  10. דם צנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 5 דקות ולמדוד ריכוז הורמונים כגון אינסולין או c-peptide באמצעות ערכת ELISA על פי פרוטוקול היצרן.
  11. לשטיפת דם, צנטריפוגה את הדם ב 1000 x גרם במשך 3 דקות. מוציאים את הסופרנטנט, מוסיפים 500 מיקרוליטר מי מלח הפריניזציה ומבצעים פיפטינג.
  12. חזור על השטיפה שוב ומקם את תאי הדם האדומים שטופים מזרק 1 מ"ל עבור העורק. תאי הדם יוחדרו מחדש באופן אוטומטי כאשר 50 או 100 מיקרוליטר של מי מלח מוחדרים בשלבים 5.2 ו -5.3. לפקח על המטוקריט בזהירות כדי למנוע היפוקסיה.
    הערה: למדידת גלוקוז בדם, נעשה שימוש במד גלוקוז שימושי מסחרי.

6. מהדק היפרגליקמי

  1. בצע את השלבים כמו טכניקת מהדק היפוגליקמי, אך ללא עירוי אינסולין ועם גלוקוז בדם מותאם 250-300 מ"ג / ד"ל. מדדו את רמות הגלוקוז בדם כל 5-10 דקות, כפי שמוצג באיור 3B, ואספו דגימות דם למדידות הורמונים ב-15- דקות, 10 דקות, 20 דקות, 40 דקות, 60 דקות, 80 דקות, 100 דקות ו-120 דקות.
  2. חבר מזרק חדש למערכת הצינורות1.4, הוציא 50 מיקרוליטר דם והכנס אותו לצינור 1.5 מ"ל לשטיפה.
  3. לדגימת דם, לחלץ 50 μL נוספים של דם ומניחים אותו בתוך צינור 1.5 מ"ל על קרח. להחדיר 100 μL (50 μL של החלפה + 50 μL של דגימה) של מלוחים.
  4. לאחר 0 דקות של מדידת גלוקוז בדם, הפעל את משאבת מזרק הגלוקוז. ראשית, יש להחדיר 30 גרם/ק"ג/דקה לבולוס למשך 2 דקות (5.1 מיקרוליטר/דקה), ולאחר מכן 10 גרם/ק"ג/דקה (1.7 מיקרוליטר/דקה) למשך שארית הזמן.
  5. למדוד את רמת הגלוקוז בדם ולשנות את קצב עירוי גלוקוז כל 5 -10 דקות במשך 120 דקות. צור מצב יציב שבו קצב עירוי הגלוקוז אינו משתנה, ורמת הגלוקוז בדם היא 250-300 מ"ג / ד"ל, מצב היפרגליקמי מהודק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר מהדק היפוגליקמי בוצע בעכברים זכרים C57BL/6N (בני 8 שבועות, יותר מ-25 גרם BW) שצמו 3 שעות בתחילת הניסוי (איור 4A,B). רמת הגלוקוז הראשונית בדם הייתה 136 מ"ג / ד"ל (t = -15 דקות). אם זה פחות מ 90 מ"ג / ד"ל, זה יכול להיות או בגלל הניתוח לא הלך טוב, או קטטר העורקים הוחדר עמוק מדי, או קרישי דם נכנסו זרימת הדם. מצב העכבר לאחר הניתוח משפיע על חילוף החומרים האנרגטי בעכבר. מטבוליזם פיזיולוגי של גלוקוז אינו ניתן למדידה בתנאים בריאותיים ירודים. C57BL נוטה יותר לקרישה לאחר ניתוח; עכברים בעלי משקל גוף גבוה יותר, כגון עכברי FVB או ICR, נוטים פחות לרדת במשקל עקב שטיפת קריש דם לאחר ניתוח. לכן, עדיף למתחילים להשתמש בעכברי FVB לתרגול נהלי מהדק. עכברי C57BL זקוקים לטיפול נמרץ יותר. החדרת קטטר 9 מ"מ לעורק לא התקשתה באיסוף דם, אפילו בעכברי FVB ו-ICR. אינסולין התחיל ב t = 0 דקות, ורמות הגלוקוז בדם ירדו (איור 4A). ה- GIR לא היה יציב בין t = 0 דקות ו- t = 70 דקות. לאחר מכן, הוא הפך למצב יציב לאחר 80 דקות.

מחקר ההידוק ההיפרגליקמי בוצע גם בעכברים זכרים C57BL/6N (בני 8 שבועות, יותר מ-25 גרם BW) שצמו 3 שעות בתחילת הניסוי (איור 4C,D). לאחר מדידת גלוקוז בדם ואיסוף דגימות דם ב t = -15 ו t = -5 דקות, גלוקוז היה חדורים מ t = 0 דקות. רמת הגלוקוז בדם הפכה ל -250 מ"ג / ד"ל ב t = 40 דקות. מצב יציב המשיך מ t = 30 דקות עד הסוף.

Figure 1
איור 1: ויסות רמות הגלוקוז בדם. (A) תרשים מושגי הממחיש את ויסות רמת הגלוקוז בדם בגוף. (ב,ג) ויסות חילוף החומרים של גלוקוז ב-(B) בדיקת סבילות לגלוקוז (GTT) ו-(C) בדיקת סבילות לאינסולין (ITT). מספר גורמים מווסתים את רמות הגלוקוז בדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הכנת צינורות ושלבי הניתוח. (A) תמונות של צינורות לעורק התרדמה ולווריד הצוואר. מספרי הצינור תואמים למספרי השלבים של הפרוטוקול. (ב) אופן הכנת הצינוריות לניתוח. (ג, ד) המיקומים הממוספרים שבהם חוטי המשי קשורים להחדרת הצנתר לעורק (C) ולווריד (D). מיקום חוטי המשי בצד הגולגולתי (C-(1)) ובצד הקאודלי של העורק (C-(2)), ועוד אחד באמצעיהם (C-(3)) (הליך 2-4). מיקום חוטי המשי בגולגולת (D-(1)) ובצד הקאודלי של הווריד (D-(2)), ועוד אחד באמצעיהם (D-(3)) (הליך 2-6). (E) תרשים של צינוריות עורקיות וורידיות היוצאות מאחור לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הגדרת המהדק. (A) דיאגרמה המציגה את ההתקנה של צינורות, משאבות, מזרקים והעכבר. (B) גיליון לרישום רמות הגלוקוז בדם ושיעור עירוי הגלוקוז. 50 μL של דם נאסף ב t = -15 דקות, 10 דקות, 20 דקות, 40 דקות, 60 דקות, 80 דקות, 100 דקות, ו 120 דקות. קצב עירוי האינסולין היה 5.1 מיקרוליטר לדקה מ t = 0 עד 2 דקות והשתנה ל 1.7 ב t = 2 דקות. רמת הגלוקוז בדם נמדדה כל 10 דקות. רמת הגלוקוז בדם נמדדה כל 5 דקות כאשר רמתו לא הייתה יציבה. שיעור עירוי הגלוקוז השתנה בכל פעם שנמדד הגלוקוז בדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות מייצגות של מהדק היפוגליקמי ומהדק היפרגליקמי. (A) רמות גלוקוז בדם ו-(B) שיעור עירוי גלוקוז של מהדק היפוגליקמי. (C) רמות גלוקוז בדם ו-(D) קצב עירוי גלוקוז של מהדק היפרגליקמי. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תמיסה חישוב עבור 20 גרם עכבר
1 U/mL אינסולין (2.647 x משקל גוף) μL 52.9 מיקרוליטר
0.1% תמיסת מלח BSA 300 μL - נפח אינסולין (μL) 247.1 μL

טבלה 1: חישוב לדוגמה להכנת אינפוזיית אינסולין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת כאן היא פשוטה שניתן לעשות עם קצוות פיפטה, מזרקים, ופריטים אחרים הנמצאים במעבדות רגילות. למרות שייתכן שהחוקרים יצטרכו לרכוש צינורות ומשאבות נוספים, אין צורך בציוד יקר. לכן, פרוטוקול זה של צנתור ומהדק קל יותר להתחיל בהשוואה לדיווחים קודמים 12,13,14.

טכניקת המהדק פותחה בסביבות 1970 ושימשה בעכברים ובבני אדם15. זוהי שיטה שימושית למדידה מדויקת של מטבוליזם גלוקוז והוא אמר להיות תקן הזהב. עם זאת, זו אינה טכניקה נפוצה בשימוש על ידי חוקרים רבים. טכניקת ההידוק ההיפראינסולינמי-אאוגליקמי דווחה בעכברים13 ובחולדות14, אך שיטת הצנתור כאן שונה, והקוראים יכולים לבחור את הקלה יותר לניסויים שלהם. אחת המטרות של מאמר זה היא להפחית את המשוכה להתחלת ניסוי. לכן, סיפקנו מידע מפורט על החומרים של קטטרים בעבודת יד, הליכים כירורגיים, ודוגמה של קורס זמן ניסיוני. אלה אינפורמטיביים עבור החוקר שמנסה לבצע מהדק בפעם הראשונה.

הפרשת אינסולין בהשמנת יתר וסוכרת היא תלוית שלב. דיווחים רבים מצביעים על הפרשת אינסולין מוגברת בהשמנת יתר כדי להפחית את רמת הגלוקוז בדם במצב עמיד לאינסולין16, אך תפקוד תאי β ייפגע בסוג 2 DM17,18. למעשה, מספר ושטח איי הלבלב והפרשת אינסולין דווחו כעלייה במודלים של עכברים הסובלים מהשמנת יתר, כגון עכברים שניזונו מתזונה עתירת שומן19 או עכברים עם מחסור בלפטין20. במודלים עכבריים אלה, שיש להם פנוטיפ ברור, ניתן לקבוע הבדלים על ידי בדיקת רמות האינסולין בדם 15-30 דקות לאחר מתן גלוקוז ב- GTT. עם זאת, במקרים מסוימים, לא קל לקבוע את ההבדלים בהפרשת אינסולין. לדוגמה, אם לעכברים טרנסגניים (Tg) יש רמת גלוקוז בדם של 500 מ"ג / ד"ל בעוד שלעכבר WT יש 300 מ"ג / ד"ל ולשני העכברים יש את אותה רמת אינסולין בדם, האם אנו יכולים לומר שהפרשת אינסולין יורדת ב- Tg? במקרה זה, איננו יכולים להשוות את יכולת הפרשת האינסולין אלא אם רמות הגלוקוז בדם זהות בשיטה שהוצגה כאן. זוהי אחת הסיבות לכך שאין תיאוריה מבוססת מתי תפקוד תאי β מתחיל להידרדר במעבר מהשמנת יתר לסוכרת. אנו יכולים גם למדוד הפרשת אינסולין על ידי תרבית ראשונית של הלבלב21 או ex vivo22. עם זאת, זה יהרוס את ההשפעה של מערכת העצבים המרכזית על שחרור אינסולין כי עצבוב של עצב הואגוס יוסר. הפרשת אינסולין לאחר ספיגה ידועה, אך המוח ומערכת העצבים האוטונומית מווסתים גם את שחרור האינסולין23. הניסוי לנתח את האחרון צריך להתבצע באוסף דם לא מורדם, בלתי מרוסן, ללא כאבים. זו גם הסיבה שיש להפריד את העצב התועה מעורק התרדמה בשלב 2.3.

סוכרת דווחה כגורמת להיפרגליקמיה עקב עמידות לאינסולין והפרשות מוגברות של גלוקגון24 והורמונים נגדיים אחרים25. בנוסף, פרקים חוזרים ונשנים של היפוגליקמיה בבני אדם עם סוכרת עקב כשלים של מינון אינסולין או סיבות אחרות יכולים להוביל למצב שנקרא היפוגליקמיה חוזרת, שבו חולים נוטים היפוגליקמיה26. הוצע כי שיעור הנפילה בגליקמיה במהדק היפוגליקמי משפיע על זיהוי היקפי או מרכזי של היפוגליקמיה27. היפוגליקמיה איטית עשויה להתאים לחקר תפקידם של חיישני גלוקוז בוורידים פורטל-מזנטריים, בעוד ירידה מהירה מאוד ברמת הגלוקוז בדם עשויה להיות לחקר חיישני גלוקוז במוח27. 1 U/mL אינסולין משמש בעכברים רזים C57BL. אבל, ריכוז אינסולין גבוה יותר יהיה צורך בעכברים שמנים כי יש להם עמידות לאינסולין, ו 1 U / mL אינו מספיק כדי להפחית את רמות הגלוקוז בדם.

במודל של תא אחד של מאגר הגלוקוז בדם (איור 1A), כמות הגלוקוז הנספגת עשויה להשפיע על קצב קלט הגלוקוז14. לפיכך, קצב ייצור הגלוקוז, אחת המטרות העיקריות של מדידת מהדק hyperinsulinemic-euglycemic, יכול להיות מושפע על ידי משך הצום. עם זאת, זמן צום ארוך עשוי להגביר את שחרורם של הורמונים נגד ויסות. לפיכך, החוקרים קובעים את זמן הצום על פי מטרת הניתוח שלהם. שיטת הידוק נוספת כוללת דגימת דם מהזנב, שהיא פשוטה מכיוון שיש להחדיר רק צינורית תוך ורידית14. עם זאת, הדם נאסף באיפוק, אשר גורם כמות מתונה של מתח ריסון עלייה קטכולאמינים פלזמה והורמוני לחץ אחרים14. בנוסף, עדיף למדוד ריכוזי הורמונים בזרימת הדם במרכז הגוף ולא בדם בגפיים. לכן, דגימת דם מעורקים בעכברים הנעים בחופשיות היא הטובה ביותר למדידת מטבוליזם של גלוקוז מבחינה פיזיולוגית. העכברים אינם זזים, ואין צורך להסתובב כאשר הם מתאקלמים בסביבת הניסוי. עם זאת, מומלץ להשתמש בסיבוב כדי למנוע הסתבכות של קווי עירוי ודגימה. צינורות 1.2 וסט צינורות 1.4 (איור 3A) אינם טובים לשימוש בסיבוב. יש לשפר את המערכת אם החוקר נדרש להשתמש בסיבוב. עירוי מחדש של תאי דם אינו משפיע על המצב היציב שנקבע של גלוקוז בדם ואינסולין. השיטה הנוכחית יכולה להיות מיושמת גם במחקרים מטאבולומיים באמצעות איזוטופים. לדוגמה, אם 13C-גלוקוז הוא חדורים ברציפות לתוך הווריד, קצב חילוף החומרים המערכתי מטבוליזם מטבוליטים תוך תאיים מטבוליטים ביניים ניתן למדוד28. לכן, זוהי שיטה שימושית לנתח מטבוליזם גלוקוז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי היוזמה המובילה לחוקרים צעירים מצטיינים (מבית MEXT); מענק סיוע למחקר מדעי (ב) (מענק מספר JP21H02352); הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED-RPIME, מספר מענק JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); קרן הזיכרון אואהארה; קרן אסטלס לחקר הפרעות מטבוליות; Suzuken Memorial Foundation, Akiyama Life Science Foundation ו-Narishige Neuroscience Research Foundation. אנו מודים גם לנור פרחאן אסגר, Ph.D, על עריכת טיוטה של כתב יד זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive glue Henkel AG & Co. KGaA LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide) Morinaga Institute of Bilogical Science Inc M1304 Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 633-03411 LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter Nipro Co. 11-777 Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml) Eli Lilly & Co. 428021014 Humulin R (100U/ml)
Mouse Japan SLC Inc. C57BL/6NCrSlc C57BL
Suture Natsume seisakusho C-23S-560 No.2 Sterilized
Syringe Pump Pump Systems Inc. NE-1000
Synthetic suture VÖMEL HR-17
Tubing1 AS ONE Corporation 9-869-01 LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2 Fisher Scientific 427400 BD Intramedic PE Tubing
Tubing3 IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. size5 Polyethylene tubing size5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
  2. Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
  3. Leanne Riley Mean fasting blood glucose. , World Health Organisation. https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022).
  4. Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
  5. Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
  6. Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
  7. Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
  8. Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
  9. Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330 (2021).
  10. Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
  11. Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141 (2017).
  12. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188 (2011).
  13. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432 (2010).
  14. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  15. DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
  16. Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
  17. Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109 (2015).
  18. Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068 (2022).
  19. Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183 (2019).
  20. Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
  21. Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
  22. Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728 (2021).
  23. Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709 (2022).
  24. Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699 (2019).
  25. Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
  26. Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
  27. Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
  28. TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).

Tags

רפואה גיליון 203
מהדק היפרגליקמי ומהדק היפוגליקמי בעכברים מודעים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Abe, T., Toda, C. Hyperglycemic… More

Abe, T., Toda, C. Hyperglycemic Clamp and Hypoglycemic Clamp in Conscious Mice. J. Vis. Exp. (203), e65581, doi:10.3791/65581 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter