Summary
Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren met behulp van dihydroethidium (DHE) als fluorescentiekleurstofsonde met behulp van een high-throughput screeningbenadering. Het protocol beschrijft de methoden voor kwantitatieve beoordeling van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de drie verschillende hepatocellulaire carcinoomcellijnen.
Abstract
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een sleutelrol bij de regulatie van het cellulaire metabolisme in fysiologische en pathologische processen. Fysiologische ROS-productie speelt een centrale rol in de ruimtelijke en temporele modulatie van normale cellulaire functies zoals proliferatie, signalering, apoptose en senescentie. Chronische ROS-overproductie daarentegen is verantwoordelijk voor een breed spectrum aan ziekten, zoals onder andere kanker, hart- en vaatziekten en diabetes. Het kwantificeren van ROS-niveaus op een nauwkeurige en reproduceerbare manier is dus essentieel voor het begrijpen van de normale cellulaire functionaliteit. Op fluorescentiebeeldvorming gebaseerde methoden om intracellulaire ROS-soorten te karakteriseren is een veelgebruikte benadering. Veel van de ROS-protocollen voor beeldvorming in de literatuur gebruiken 2'-7'-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFH-DA) kleurstof. Deze kleurstof heeft echter aanzienlijke beperkingen in het gebruik en de interpreteerbaarheid. Het huidige protocol demonstreert het gebruik van een dihydroethidium (DHE) fluorescentiesonde als een alternatieve methode om de totale ROS-productie in een high-throughput omgeving te kwantificeren. Het high throughput imaging platform, CX7 Cellomics, werd gebruikt om de ROS-productie te meten en te kwantificeren. Deze studie werd uitgevoerd in drie hepatocellulaire kankercellijnen - HepG2, JHH4 en HUH-7. Dit protocol geeft een diepgaande beschrijving van de verschillende procedures die betrokken zijn bij de beoordeling van ROS in de cellen, waaronder: bereiding van DHE-oplossing, incubatie van cellen met DHE-oplossing en meting van DHE-intensiteit die nodig is om de ROS-productie te karakteriseren. Dit protocol toont aan dat DHE fluorescerende kleurstof een robuuste en reproduceerbare keuze is om intracellulaire ROS-productie op een high-throughput manier te karakteriseren. Benaderingen met een hoge doorvoer om de ROS-productie te meten, zijn waarschijnlijk nuttig in een verscheidenheid aan onderzoeken, zoals toxicologie, drugsscreening en kankerbiologie.
Introduction
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn een groep van natuurlijk voorkomende, zeer reactieve en tijdelijk onstabiele chemische radicalen die worden gevormd als onderdeel van het normale cellulaire metabolisme in cellen. ROS speelt een belangrijke en essentiële rol bij de modulatie van normale fysiologische en biochemische processen die plaatsvinden in cellen 1,2. De belangrijkste bron van ROS-productie in cellen is afkomstig van de mitochondriale elektronentransportketen (ETC)-route als onderdeel van de normale bio-energetische cyclus. Belangrijke aanvullende bronnen van ROS-productie zijn enzymatische reacties zoals cellulaire NADPH-oxidasen in cellen. Het metabolisme van voedselmoleculen (bijv. glucose) vindt plaats via de oxidatieve fosforyleringsroute in de mitochondriale matrix. Een basisniveau van ROS-productie is essentieel om normale fysiologische celsignaleringsprocessen te reguleren. Van veel belangrijke eiwitmoleculen die deel uitmaken van de glucosemetabole signaleringsroutes (bijv. Akt en PTEN) is bekend dat ze reageren op intracellulaire ROS-niveaus. Bovendien worden ROS geproduceerd door verschillende intracellulaire enzymen zoals xanthine-oxidase, stikstofmonoxidesynthase en peroxisomale bestanddelen als onderdeel van de cellulaire enzymatische routes 1,2. In tegenstelling tot de natuurlijke bronnen van ROS, leiden bepaalde omgevingsfactoren, zoals xenobiotica, infectieuze agentia, UV-licht, vervuiling, het roken van sigaretten en straling, ook tot overmatige productie van ROS, die een belangrijke oorzaak zijn van intracellulaire oxidatieve stress 1,3. Verhoogde cellulaire oxidatieve stress kan schade veroorzaken aan natuurlijke biomoleculen in een cel, zoals lipiden, eiwitten en DNA, en verschillende ziekten veroorzaken, zoals kanker, diabetes, hart- en vaatziekten, chronische ontstekingen en neurodegeneratieve aandoeningen 1,3,4. Daarom zijn nauwkeurige metingen van ROS essentieel om de cellulaire mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij de pathofysiologie van oxidatieve stress-geïnduceerde ziekten.
Vanwege de korte tijdschalen van ROS-productie en -eliminatie in cellen, blijven kwantitatieve metingen van verschillende ROS-radicalen een uitdaging. Methoden zoals elektronenparamagnetische resonantie (EPR)5, hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en beeldvorming op basis van fluorescentiesondes worden gebruikt om de verschillende cellulaire ROS6 te meten. Hoewel methoden zoals EPR en HPLC kwantitatief nauwkeurige schattingen opleveren, omvatten deze methoden de vernietiging van de cellulaire ruimtelijke morfologie en zijn ze meestal in de vorm van globale en bulkmetingen van een monster. Daarentegen behouden op beeldvorming gebaseerde methoden, zoals op fluorescentiesondes gebaseerde methoden, de cellulaire morfologie en ruimtelijke context van de ROS-generatie. De specificiteit van verschillende fluorescentiesondes voor verschillende soorten ROS-radicalen is echter niet goed vastgesteld 7,8. Verschillende fluorescerende sondes zoals dihydroethidium (DHE), dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFH-DA), dihydrorhodamine (DHR), dimethylantraceen (DMA), 2,7-dichloordihydrofluresceïne (DCFH), 1,3-difenylisobenzofuraan (DPBF) en MitoSox zijn commercieel beschikbaar voor ROS-detectie. In de afgelopen decennia zijn DHE, MitoSox en DCFH-DA de meest gebruikte fluorescerende kleurstoffen om ROS in cellen en weefsels te meten 8,9. DCFH-DA is een veelgebruikte kleurstof voor het detecteren van intracellulaireH2O2 en oxidatieve stress. Ondanks de populariteit van DCFH-DA, hebben meerdere eerdere onderzoeken aangetoond dat het niet betrouwbaar kan worden gebruikt om intracellulaire H2O2 en andere ROS-niveaus 8,9,10,11,12,13,14 te meten.
De fluorescerende sonde dihydroethidium (DHE) daarentegen vertoont een specifieke respons op de intracellulaire superoxideradicaal (O2-). Hoewel het superoxideradicaal een van de vele ROS-soorten is die in cellen worden waargenomen, is het een belangrijk radicaal dat betrokken is bij de vermindering van overgangsmetalen, omzetting in peroxynitraat en de vorming van hydroperoxiden, naast andere intracellulaire effecten. DHE wordt snel opgenomen door de cellen en heeft een fluorescentie-emissie in het rode golflengtebereik15. Bij reactie met specifiek superoxideradicaal vormt DHE een rood fluorescerend product, 2-hydroxy-ethidium (2-OH-E+). DHE kan dus worden beschouwd als een specifieke sonde voor de detectie van superoxide. DHE kan echter ook niet-specifieke oxidatie ondergaan met ONOO- of OH., H2O2 en cytochroom c om een tweede fluorescentieproduct te vormen, ethidium E+, dat de gemeten 2-OH-E+-niveaus kan verstoren. Deze 2-OH E+ en E+ producten, in combinatie, vertegenwoordigen echter een groot deel van de totale cellulaire ROS-soorten die in een cel worden waargenomen wanneer ze worden gekleurd met DHE. E+ intercaleert in DNA, waardoor de fluorescentie ervan aanzienlijk wordt verbeterd 8,9,10,11,13,14,15,16. Aangezien de fluorescentiespectra van ethidium en 2-hydroxyethidium slechts in geringe mate verschillen, kan de meerderheid van de ROS-niveaus die worden waargenomen in een cel secundair aan superoxideproductie worden gedetecteerd en gemeten met behulp van DHE-fluorescentieproducten. Deze ROS-soorten worden geïdentificeerd met behulp van 480 nm golflengte-excitatie en 610 nm golflengte-emissie 15,16,17.
Naast het kiezen van een specifieke fluorescerende ROS-detectiesonde, is het belangrijk om een gevoelige detectiemethode te kiezen om intracellulaire ROS te meten. Nauwkeurige beoordeling van intracellulaire ROS-niveaus is dus de sleutel tot het identificeren van verstoorde redoxbalanstoestanden die optreden in zieke cellen of cellen die zijn blootgesteld aan verschillende omgevingsstressoren zoals straling, toxicologische verbindingen en genotoxische agentia18. Aangezien ROS een veel voorkomend fenomeen is in cellen dat verantwoordelijk is voor het reguleren van een verscheidenheid aan celsignaleringsactiviteiten, zijn robuuste detectiemethoden van ROS essentieel. Om een dergelijke high-throughput evaluatie van de ROS-productie in cellen mogelijk te maken, maakt dit protocol gebruik van een high-content screening (HCS)-platform om de ROS-soorten te meten. Het huidige protocol maakt de high-throughput analyse van intracellulaire ROS-productie mogelijk, wat van cruciaal belang is in veel toxicologische studies19. Dit protocol heeft tot doel een eenvoudige en veelzijdige oplossing te bieden voor het detecteren en meten van intracellulaire ROS in aanhangende hepatocellulaire carcinoomcellen. De chemische reagentia vanH2O2 en menadion worden gebruikt als krachtige ROS-stimulatoren om de relatieve niveaus van ROS-productie te meten in een gecontroleerde omgeving met hoge doorvoer. Dit protocol kan worden verfijnd om de ROS-productie in aanhangende en niet-aanhangende cellen onder passende omstandigheden te meten, indien nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek
- Zaai de testcellen (HepG2-, HUH7- en JHH4-hepatocellulaire carcinoomcellen) in een plaat met 96 putjes met een zaaidichtheid van 10.000 cellen/putje in een uiteindelijk zaaivolume van 200 μL per putje.
- Voordat u de HepG2-cellen kweekt, smeer u de 96 plaatputjes in met type IV collageen (50 μg/ml) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT). Om stolling van het collageen te voorkomen, plaatst u de stockoplossing in ijs en start u vervolgens het verdunningsproces tot de gewenste concentratie.
- Na een incubatietijd van 2 uur het overtollige collageen afzuigen en de putjes drie keer wassen met de 1x PBS.
- Kweek de cellen 's nachts in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) bij 37 °C en 5% CO2 - concentratie in een bevochtigde incubator.
- Behandel de cellen de volgende dag, of bij het bereiken van de 80%-90% confluentie, afhankelijk van wat zich het eerst voordoet, de cellen met respectievelijk H2O2 (onbehandeld, 250 μM, 500 μM, 750 μM en 1000 μM) en Menadion (onbehandeld, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) om de representatieve oxidatieve stress te induceren.
- U kunt er ook voor kiezen om de cellen te testen met de gewenste teststof naar keuze die oxidatieve stress in de cellen kan veroorzaken.
2. Bereiding van de voorraad- en verdunde oplossing voor DHE-kleuring van cellen
- Bereid DHE-voorraadoplossing (5 mg/ml of 15,9 mM) door 5 mg DHE op te lossen in 1 ml DMSO.
- Verdun de DHE-stockoplossing met dubbel gedestilleerd geautoclaveerd water tot een uiteindelijke concentratie van 100 μM.
- Om het bevriezings- en dooiproces van de kleurstof te voorkomen (wat de fluorescentie-eigenschappen na verloop van tijd kan beschadigen), bereidt u verschillende aliquots in centrifugebuisjes van 1,5 ml met een concentratie van 100 μM en bewaart u deze bij -20 °C.
- Om een uiteindelijke werkconcentratie van 10 μM te bereiken, gebruikt u een aliquot van de DHE-concentratie van 100 μM en verdunt u deze met voorverwarmde DMEM-media.
OPMERKING: De werkoplossing moet op de dag van het experiment vers worden bereid. - Draai de werkende fluorescentiekleurstofoplossing gedurende 5-10 s om een goede menging van de kleurstof te garanderen.
3. DHE-kleuringsproces
- Verwijder het medium dat het geneesmiddel of de teststof bevat uit elk putje en was het voorzichtig één keer met 1x PBS of DMEM.
OPMERKING: Bij het uitvoeren van de additie- of wasstappen in het experiment is het van cruciaal belang om direct contact tussen de cellen en de pipettor te vermijden. Dit kan worden bereikt door de PBS voorzichtig langs de zijkanten van de putten te pipetteren om mogelijke mechanische schade aan de cellen te minimaliseren. Door ervoor te zorgen dat de pipettor de cellen niet rechtstreeks raakt, blijft de integriteit en levensvatbaarheid van de cel behouden voor de duur van het experiment. - Voeg 100 μL DMEM-media met 10 μM DHE (werkoplossing) toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Verwijder na een incubatietijd van 30 minuten de DHE-bevattende media en was elk putje drie keer voorzichtig met de 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Dit kan worden uitgevoerd met een meerkanaals pipettor om een snelle doorlooptijd te garanderen.
- Voeg 200 μL 1x PBS toe aan elk putje met Hoechst 33342 nucleaire kleurstof gedurende 10 minuten bij RT.
- Verwijder de Hoechst 33342 nucleaire kleuringsoplossing uit het putje en voeg 200 μL 1x PBS toe aan elk putje.
OPMERKING: Om vaste cellen te verkrijgen, volgt u hetzelfde protocol als voor de levende cellen, met een extra stap van het toevoegen van 4% PFA gedurende 5 minuten na de behandeling en DHE-kleuring. Verwijder de PFA-oplossing en was de cellen met de 1x PBS. Incubeer vervolgens de cellen met de nucleaire kleurstof gedurende 10 minuten. - Verplaats de plaat zo snel mogelijk naar het screeningplatform met hoge inhoud, fluorescentiemicroscopie of plaatlezer voor beeldacquisitie.
4. Beeldacquisitie en intensiteitsmeting
- Plaat laden
- Open de Cellomics CX7 high-content screening (HCS) software voor data-acquisitie.
- Kalibreer het beeldvormingsplatform zorgvuldig van tevoren volgens de specificaties van de fabrikant met de specifieke plaat met 96 putjes naar keuze voor gebruik om wazige of wazige beelden in de gegevens te voorkomen.
OPMERKING: Multi-well-platen van verschillende leveranciers kunnen verschillende materiaaleigenschappen hebben en kunnen de kwaliteit van de verkregen uiteindelijke afbeeldingen beïnvloeden. - Eenmaal gekalibreerd, slaat u de systeemparameters die specifiek zijn voor het plaatmerk op in de instrumentendatabase en gebruikt u ze opnieuw voor toekomstige gegevensacquisities.
- Plaats de plaat met de voorbereide monsters voorzichtig op de verwarmde tafel van het HCS-beeldvormingssysteem. Zorg ervoor dat de plaat stevig en in de juiste richting is geplaatst voor beeldvorming op de microplaathouder (d.w.z. zoek het label gemarkeerd met A1 op de lezertafel en draai vervolgens de microplaat zodat de locatie van putje A1 overeenkomt met de hoek met de sticker).
- Druk voorzichtig op de microplaat om ervoor te zorgen dat deze plat tegen de tafel rust. Ongelijkmatige nivellering van de plaat in het HCS-systeem kan leiden tot fouten in de beeldacquisitie.
- Nadat de plaat op zijn plaats zit, houdt u de Ctrl-toets ingedrukt en klikt u vervolgens op Ctrl-OK in het dialoogvenster Plaat laden/lossen in de software.
- Beeldvormingsparameters selecteren
- Open in het HCS-beeldvormingssysteem de Target Activeringsmodus in de Cellomics-interface voor biotoepassingen en maak een nieuw protocol met behulp van het tweekanaals installatieprotocol dat compatibel is met (a) nucleaire kleuring en (b) DHE-fluorescentiesondegegevensverzameling. In het huidige protocol werden de filters 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS en 386_BGS_RS gebruikt voor respectievelijk (a) Hoechst 33342 nucleaire kleuring, (b) totale ROS-productie en (c) detectie van superoxideradicalen. De keuze voor deze filters werd ingegeven door de specifieke overlap voor de emissie-eigenschappen van elke kleurstof (DAPI en DHE) die als onderdeel van dit protocol wordt gebruikt.
OPMERKING: De naamgevingsconventie van filters, bijv. 386-23_BGRFRN_BGRFRN, verwijst naar de excitatie van het monster met 386 nm licht met een bandbreedte van 23 nm, gevolgd door een dichroïsch filter dat blauw (B), groen (G), rood (R), verrood (FR) en nabij-infrarood (N) licht doorlaat op specifieke golflengtebereiken en de 386_BGS_RS verwijst naar een emissiefilter dat BGS- en RS-emissiegolflengtelicht doorlaat na het dichroïsch. - Specificeer indien nodig de doelstellingen voor het beeldacquisitieproces binnen de softwareprotocolinterface, zoals 10x of 20x vergroting.
- Kies de juiste objectiefvergroting, afhankelijk van het gewenste detailniveau en de resoluties die nodig zijn voor het experiment. De resolutie van elk doel staat echter vast. Bij een hogere resolutie moet het doel op het platform worden vervangen. In het huidige protocol wordt een 20x, 0,45 NA-doelstelling gebruikt, die deel uitmaakt van het high-content screeningplatform dat in dit protocol wordt gebruikt.
OPMERKING: Het 20x-objectief vertegenwoordigt een goede afweging tussen details van de beeldresolutie en de snelheid van acquisitie die nodig is om ROS-veranderingen in de loop van de tijd vast te leggen. Er kunnen objectieven met een hogere vergroting worden gekozen (bijv. 40X), maar dit zal leiden tot langere acquisitietijden. - Specificeer de belichtingsinstellingen van de beeldacquisitiecamera, zoals de belichtingstijd, camerabinning en z-stack-interval, volgens de specifieke vereisten van het protocol.
OPMERKING: De belichtingstijd (vaak in milliseconden) varieert op basis van de signaalsterkte en gevoeligheid van de specifieke fluoroforen die worden gebruikt. Dit kan ook enigszins verschillen van experiment tot experiment op basis van de kleurstofconcentratie en kleurkwaliteit. In het huidige protocol zijn de parameters van acquisitie als volgt vastgesteld: doel% - 35%, beeldacquisitiemodus - 1104 x 1104 (met 2x2 binning) en objectief 20x, 0,45 NA. Deze parameters kunnen worden ingesteld op basis van de specifieke experimentele omstandigheden.
- Open in het HCS-beeldvormingssysteem de Target Activeringsmodus in de Cellomics-interface voor biotoepassingen en maak een nieuw protocol met behulp van het tweekanaals installatieprotocol dat compatibel is met (a) nucleaire kleuring en (b) DHE-fluorescentiesondegegevensverzameling. In het huidige protocol werden de filters 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS en 386_BGS_RS gebruikt voor respectievelijk (a) Hoechst 33342 nucleaire kleuring, (b) totale ROS-productie en (c) detectie van superoxideradicalen. De keuze voor deze filters werd ingegeven door de specifieke overlap voor de emissie-eigenschappen van elke kleurstof (DAPI en DHE) die als onderdeel van dit protocol wordt gebruikt.
- Configuratieparameters voor beeldvorming
OPMERKING: Zodra de beeldvormingsparameters zijn ingesteld, kan het beeldverzamelingsproces worden gestart met behulp van de software-interface.- Parameters voor beeldverzameling
- Identificeer het primaire volgobject van belang (de kern van de cellen) met behulp van verschillende algoritmen die beschikbaar zijn in het instrument (optica - isodata, vast en driehoek).
OPMERKING: In dit protocol wordt de isodata-methode gebruikt voor de identificatie en markering van het primaire object. - Segmenteer het object (indien aanwezig) op vorm of intensiteitsparameter.
- Valideer het primaire object op basis van de gewenste grootte, vorm en intensiteitsparameters die uniek zijn voor elk celtype.
- Definieer vervolgens de 'regio van belang' (ROI) rond dit primaire object.
OPMERKING: De ROI is een belangrijke parameter voor gegevensverzameling die de locatie definieert waar de intensiteit van de fluorescentiekleurstof wordt geïdentificeerd als consistent en herhaalbaar voor alle celtypen. De ROI definieert de belangrijkste parameters (zoals de intensiteit van de kleurstof), die worden gemeten voor elk primair volgobject (d.w.z. een cel) in verschillende kanalen van het instrument. De ROI kan worden gedefinieerd in de vorm van een cirkel of ring rond de kern van elke cel. De HCS-software verkrijgt automatisch de intensiteit van de DHE-fluorescentiekleurstofmarker in kanaal 2 binnen de limiet van de ROI voor elke cel die op een geautomatiseerde manier wordt gesegmenteerd en geanalyseerd. - Stel een cirkel van 20 μm in rond het primaire object (kern). De afstand van 20 μm werd in deze studie gekozen op basis van de geschatte grootte van de verschillende cellijnen die in dit protocol worden gebruikt (HepG2, JHH-4 en HUH-7). De ring-ROI van 20 μm rond de cellen verkreeg de fluorescentie-intensiteit op een consistente en herhaalbare manier.
OPMERKING: De belangrijkste parameter bij het kiezen van een ROI is het vermogen om het celgebied adequaat te bestrijken; de grootte van de circulaire ROI is afhankelijk van de celgrootte. Grotere cellen kunnen een grotere ROI vereisen en vice versa voor een kleinere ROI. Deze parameters moeten van tevoren worden bepaald voor elk celtype en elke fluorescentiekleurstof die van belang is.
- Identificeer het primaire volgobject van belang (de kern van de cellen) met behulp van verschillende algoritmen die beschikbaar zijn in het instrument (optica - isodata, vast en driehoek).
- Parameters voor beeldverzameling
- Populatiekarakterisering en geselecteerde functies om op te slaan
- Zodra de verschillende acquisitieparameters zijn gedefinieerd in het HCS-beeldvormingsprotocol, stelt u het HCS-systeem in de data-acquisitiemodus.
- De beeldacquisitieparameters voor dit protocol zijn als volgt ingesteld: een scanlimiet van 1000 cellen/put, met een minimumvereiste van 10 objecten (cellen) per veld.
OPMERKING: Het aantal velden dat voor elk putje is beoordeeld, is bepaald op basis van het uiteindelijke aantal cellen dat het aantal 1000 bereikt. Het HCS-systeem blijft verschillende locaties in de put doorzoeken totdat het de doelpopulatie van 1000 cellen/put heeft bereikt. De acquisitiesnelheid hangt dus af van de samenvloeiing en het totale aantal cellen dat aanwezig is in elk putje van de plaat met 96 putjes. In het huidige protocol werden de totale en gemiddelde intensiteit van kanaal 2 (die de superoxideradicalen en de totale ROS-productie vertegenwoordigen) uit elke put verzameld voor verdere stroomafwaartse analyses.
- Beeldopname, -verwerking en -analyse
- Nadat u de parameters voor beeldacquisitie hebt aangepast en voltooid, start u het scanproces voor elke plaat met 96 putjes.
OPMERKING: Het Cellomics CX7-beeldvormingssysteem maakt screening met een hoog gehalte en geautomatiseerde analyse van monsters van verschillende parameters mogelijk, waaronder ROS-productie in cellen op een manier met hoge doorvoer. Naast de ROS-productie is het HCS-systeem in staat om aanvullende waardevolle informatie te verstrekken over verschillende parameters, zoals celmorfologie, subcellulaire lokalisatie en vele andere cellulaire kenmerken die van belang zijn. Eenmaal geoptimaliseerd voor acquisitie, maakt het HCS-beeldvormingsplatform uitgebreide, kwalitatieve en kwantitatieve karakterisering van celparameters op een robuuste manier mogelijk. - Nadat het scanproces is voltooid, start u de View Analysis-software en exporteert u de verschillende kwantitatieve gegevensparameters in een .csv formaat voor aanvullende analyse.
- Kopieer en plak met behulp van software van derden de verschillende kwantitatieve waarden die van belang zijn voor aanvullende downstream-analyses.
OPMERKING: In het huidige protocol werd GraphPad Prism-software gebruikt om de DHE-intensiteitswaarden te analyseren als reactie op geïnduceerde oxidatieve stress als gevolg van blootstelling aan H2O2 en menadion.
- Nadat u de parameters voor beeldacquisitie hebt aangepast en voltooid, start u het scanproces voor elke plaat met 96 putjes.
- Gegevens en statistische analyse
- Bereken de gemiddelde gemiddelde intensiteit van kanaal 2 (die de totale ROS-waarden en superoxideradicalen weergeeft).
OPMERKING: Alle experimenten om de intensiteitswaarden te berekenen werden drie keer herhaald met 6 replicaten per toestand op elk doseringsniveau. - Voer eenrichtings-ANOVA of t-test uit om de verschillen in de intensiteitswaarden tussen verschillende testomstandigheden te meten.
- Bereken de gemiddelde gemiddelde intensiteit van kanaal 2 (die de totale ROS-waarden en superoxideradicalen weergeeft).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dihydroethidium (DHE) is een superoxide-responsieve fluorescentiekleurstof die specifieke informatie geeft over de intracellulaire ROS-toestanden. DHE-kleurstof zendt intrinsiek blauwe fluorescentie uit in het cytoplasma. Bij interactie met superoxideradicalen wordt het echter omgezet in 2-hydroxyethidium, dat fluorescentie uitzendt in de rode golflengten (>550 nm) (Figuur 1). DHE-kleurstof wordt gemakkelijk naar de cellen en de kern getransporteerd. De uitgezonden fluorescentie kan worden gevisualiseerd met een fluorescentiemicroscopie-opstelling die in veel laboratoria algemeen beschikbaar is. In de huidige studie werd het nut van DHE-kleurstof op meerdere hepatocellulaire carcinoomcellijnen - HUH7-, JHH4- en HepG2-cellen als een sonde voor het genereren van ROS-soorten getest op een screeningplatform met een hoog gehalte. De cellen werden behandeld met twee ROS-genererende middelen - (a) waterstofperoxide en (b) menadion gedurende 30 minuten op een dosisafhankelijke manier (zie figuur 2 en figuur 3 voor doseringsdetails) om oxidatieve stress in de cellen te induceren, gevolgd door DHE-kleurstofetikettering in een plaat met 96 putjes. ZowelH2O2 als menadion verhoogden de fluorescentie-intensiteit dramatisch in alle drie de cellijnen op een dosisafhankelijke manier. Met behulp van de beeldsegmentatie- en kwantificeringsalgoritmen binnen het high-throughput screeningplatform werd de intensiteit van ROS-geïnduceerde DHE-fluorescentie gekwantificeerd in 1000 cellen per put over zes replicaten. Er werden drie onafhankelijke replicaten gemeten en de resultaten werden geaggregeerd en geanalyseerd. De Hoechst 33342 kernkleuring speelt een belangrijke rol bij het identificeren van het vlak waarin de aanhangende cellen in elk putje aanwezig zijn. Bovendien kunnen de 2-OH-E+ en E+ fluorescentie worden gedetecteerd in respectievelijk de kern en het cytoplasma van de geteste cellen op het high-throughput screeningplatform (zie figuur 4).
Blootstelling aanH2O2 resulteerde in een statistisch significante toename van de ROS-geïnduceerde fluorescentie over alle cellijnen die op een dosisafhankelijke manier werden geanalyseerd (zie figuur 2; onderste paneel). Een dergelijke dosisafhankelijke respons werd echter niet waargenomen in het geval van blootstelling aan menadion. Bij menadion vertoonde de JHH4-cellijn een dosisafhankelijke toename van de fluorescentie-intensiteit, terwijl in HepG2- en HUH7-cellijnen alleen een significant verschil in fluorescentie-intensiteit werd waargenomen bij de hogere menadionconcentraties (zie figuur 3; onderste paneel). Deze verschillen in ROS-generatieresponsen kunnen te wijten zijn aan de verschillende mechanismen van ROS-productie vanH2,O2 en menadion. TerwijlH2O2 ROS-vorming in cellen op een meer directe manier op gang brengt (bijvoorbeeld door de werking van antioxiderende enzymen zoals peroxidasen en catalasen), wordt verondersteld dat menadion op een indirecte manier ROS-soorten genereert door geïnduceerde mitochondriale disfunctie. Vanwege het indirecte mechanisme van ROS-productie kan DHE-fluorescentie meer tijd nodig hebben om zich te manifesteren met menadion. Deze bevindingen geven aan dat ROS-afhankelijke DHE-fluorescentie gevoelig is voor de duur van blootstelling aan oxidatieve stress, concentratie en celtypen. Optimalisatie van het experimentele protocol voor elk uniek celtype is dus een must. Wat nog belangrijker is, dit protocol toont de haalbaarheid aan van het gebruik van DHE-kleurstof als ROS-detectiemiddel op een high-throughput-manier, die van nut is op gebieden zoals toxicologie, kankerbiologie en drugsscreening.
Figuur 1: Een schema dat de routes van oxidatieve omzetting van DHE-fluorescentiemoleculen in respectievelijk 2-hydroxyethidium (2-OH-E+) en ethidium (E+) illustreert. De fluorescentie-emissiespectra van 2-OH-E+ en E+ overlappen elkaar bij een excitatie van 480 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Behandeling met waterstofperoxide verhoogt de intracellulaire ROS-niveaus op een dosisafhankelijke manier. Hepatocellulair carcinoomcellen - (A) HUH7, (B) JHH4 en (C) HepG2 werden behandeld met H2O2 in doses van 250 μM, 500 μM, 750 μM en 1000 μM gedurende een periode van 30 minuten. De cellen werden nog eens 30 minuten gekleurd met DHE (10 μM) kleurstof in kweekmedia, gevolgd door Hoechst 33342 nucleaire kleuring. In elke put werden in totaal 1000 cellen geteld. Een lineaire, dosisafhankelijke toename van de DHE-fluorescentie wordt waargenomen over alle drie de cellijnen (bovenste paneel). Statistisch significante verhogingen van fluorescentie worden waargenomen in alle cellijnen voor dosering van 500 μM en hoger (onderste paneel). Elke dataset is een gemiddelde van zes replicaten in een plaat met 96 putjes, verkregen uit drie onafhankelijke experimenten (n = 3). De behandelingsomstandigheden werden vergeleken met onbehandelde monsters met behulp van een eenrichtings-ANOVA-test (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; beeldschaalbalk - 50 μm) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Behandeling met menadion verhoogt de intracellulaire ROS-niveaus op een dosisafhankelijke manier. Hepatocellulair carcinoomcellen - (A) HUH7, (B) JHH4 en (C) HepG2 werden behandeld met menadion in doses van 25 μM, 50 μM, 75 μM en 100 μM gedurende een periode van 30 minuten. De cellen werden nog eens 30 minuten gekleurd met DHE (10 μM) kleurstof in kweekmedia, gevolgd door Hoechst 33342 nucleaire kleuring. In elke put werden in totaal 1000 cellen geteld. Een lineaire, dosisafhankelijke toename van de DHE-fluorescentie wordt waargenomen over alle drie de cellijnen (bovenste paneel). Statistisch significante verhogingen van de fluorescentie worden consequent waargenomen voor de maximale dosis (100 μM; onderste paneel). Variabiliteit wordt waargenomen voor de resterende doses menadion over verschillende cellijnen (JHH4 > HUH7 > HepG2). Elke dataset is een gemiddelde van zes replicaten in een plaat met 96 putjes, verkregen uit drie onafhankelijke experimenten (n = 3). De behandelingsomstandigheden werden vergeleken met onbehandelde monsters met behulp van een eenrichtings-ANOVA-test (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; beeldschaalbalk - 50 μm) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Eencellige DHE-fluorescentie - Een close-up van de DHE-fluorescentieveranderingen waargenomen na behandeling met (A) waterstofperoxide en (B) menadion gedurende een duur van 30 minuten. Cytoplasmatische en nucleaire veranderingen van DHE-fluorescentie worden waargenomen in de verschillende cellen. Het automatische segmentatiemasker dat wordt gegenereerd door het high-content screeningplatform is ook te zien. Schaalbalk afbeelding - 10 μm. Vergroting - 20x. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Beeldvorming van superoxide-gedreven DHE-fluorescentie als reactie op waterstofperoxide. Hepatocellulair carcinoomcellen - (A) HUH7, (B) JHH4 en (C) HepG2 werden behandeld met H2O2 in doses van 250 μM, 500 μM, 750 μM en 1000 μM gedurende een periode van 30 minuten. De cellen werden vervolgens gekleurd met DHE (10 μM) kleurstof in kweekmedia gedurende nog eens 30 minuten. Vervolgens werden de cellen verlicht met 386 nm LED en fluorescentiebeeldvorming verzameld bij >560 nm. Er werd geen nucleaire tegenkleuring gedaan om spectrale overspraak te voorkomen. Een dosisafhankelijke toename van DHE-fluorescentie wordt waargenomen bij doses > 500 μM. UV-verlichte DHE-fluorescentie zal naar verwachting het gevolg zijn van het grootste deel van de productie van superoxideradicalen. Elke dataset is een gemiddelde van zes replicaten in een plaat met 96 putjes, verkregen uit twee onafhankelijke experimenten (n = 2). Behandelingscondities werden vergeleken met onbehandelde monsters met behulp van een eenrichtings-ANOVA (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; beeldschaalbalk - 50 μm) Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Beeldvorming van superoxide-gedreven DHE-fluorescentie als reactie op menadion - Hepatocellulair carcinoomcellen - (A) HUH7, (B) JHH4 en (C) HepG2 werden behandeld met menadion in doses van 25 μM, 50 μM, 75 μM en 100 μM gedurende een periode van 30 minuten. De cellen werden vervolgens gekleurd met DHE (10 μM) kleurstof in kweekmedia gedurende nog eens 30 minuten. Net als bij waterstofperoxide werd een dosisafhankelijke toename van DHE-fluorescentie waargenomen. Elke dataset is een gemiddelde van zes replicaten in een plaat met 96 putjes, verkregen uit twee onafhankelijke experimenten (n = 2). Behandelingsomstandigheden werden vergeleken met onbehandelde monsters met behulp van een eenrichtings-ANOVA (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; beeldschaalbalk - 50 μm) Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werd een protocol opgesteld om de productie van superoxide-gedreven intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te beoordelen met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof op een screeningsysteem met een hoog gehalte. Een meerderheid van de huidige protocollen die in de literatuur beschikbaar zijn, gebruiken de DCFH-DA als een fluorescentiebeeldvormingssonde om ROS-soorten te kwantificeren. Meerdere onderzoeken hebben echter aangetoond dat de DCFH-DA geen ideale sonde is voor het meten van intracellulaire ROS. Verschillende redenen die worden gepostuleerd voor de ongeschiktheid van DCFH-DA als sonde zijn onder meer: (i) DCFH-DA vertoont geen directe reactie met H2O2, waardoor het een ongeschikte kleurstof is voor het evalueren van het intracellulaire H2O2-niveau. (ii) Verschillende oxiderende soorten met één elektron, zoals OH, NO2 en ONOO-, oxideren DCFH tot DCF. iii) overgangsmetalen, cytochroom C en heemperoxidase kunnen DCFH-oxidatie bevorderen in aanwezigheid van zuurstof enH2O2. (iv) Het belangrijkste is dat DCFH-DA het tussenproduct DCFH.- / DCF. produceert, dat, in aanwezigheid van zuurstof, de productie van extra superoxide induceert. Dismutatie met O2.- genereert extra H2O2, wat kan resulteren in een kunstmatige toename van de fluorescentie-intensiteit en ten onrechte verhoogde ROS-niveaus. Meerdere auteurs hebben het gebruik van DCFH-DA beschouwd als een onbetrouwbare fluorescerende sonde voor de detectie van intracellulaireH2O2 en andere ROS-soorten 8,9,10,11,12,13,14.
In tegenstelling tot DCFH-DA reageert DHE specifiek met het superoxideradicaal, wat leidt tot de vorming van een fluorescerend product, 2-hydroxyethidium (2-OH E+). Niet-superoxide ROS-soorten kunnen ook reageren met DHE om een tweede fluorescerend product te genereren, ethidium (E+). Hoewel de fluorescentiespectra van 2-OH-E+ en E+ relatief vergelijkbaar zijn, vertegenwoordigen deze twee moleculen de eindproducten van de specifieke interacties tussen de intracellulaire ROS-soorten en DHE en zijn ze verantwoordelijk voor de totale fluorescentie-intensiteit die in de cellen wordt waargenomen als gevolg van oxidatieve stress. Sommige onderzoeken hebben aangetoond dat selectieve excitatie bij golflengten van het kortere UV-bereik (<400 nm) specifieker kan zijn voor 2-OH-ethidiumexcitatie (in tegenstelling tot E+) en dus voor de productie van superoxideradicalen 7,12,14. Dit werd beoordeeld door de cellen alleen met 386 nm LED-licht te prikkelen. Ten opzichte van de excitatie van de golflengte van 480 nm werd een verminderde intensiteit van de emissie waargenomen bij een golflengte van 560 nm (zie aanvullende figuur 1 en aanvullende figuur 2). Men kan er echter niet zeker van zijn dat dit uitsluitend te wijten is aan 2-OH Ethidiumfluorescentie alleen en een potentiële tekortkoming van de huidige aanpak vertegenwoordigt. Andere studies hebben aangetoond dat UV-excitatie (bijv. 386 nm) ook kan resulteren in gelijktijdige ethidiumfluorescentie-emissie, zij het op lagere niveaus in vergelijking met 2-OH ethidium 7,15. Hoe dan ook, ons protocol stelt DHE vast als een beter kleurstofalternatief om de kwantitatieve verschillen van het grootste deel van de intracellulaire ROS-productie te meten met behulp van een beeldvormings- en screeningsysteem met een hoog gehalte.
Het ontbreken van tussenliggende drijfveren voor ROS-generatie (zoals die in DCFH-DA) wordt verondersteld een groot voordeel te zijn bij het gebruik van DHE om de intracellulaire ROS-productie te evalueren. Dit mechanisme van DHE-fluorescentie is echter nog niet stevig vastgesteld. In gevallen waarin nauwkeurige kwantificering van de ROS-niveaus noodzakelijk is, wordt geadviseerd om aanvullende orthogonale methoden van kwantitatieve validatie te gebruiken, zoals HPLC- en/of vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS)-methoden om de niveaus van 2-OH-E+ in de cellen nauwkeurig te schatten 8,9,13. Men moet zich er echter van bewust zijn dat HPLC- en LC-MS-methoden noodzakelijkerwijs aggregatie en oplosbaarheid van de cellen voor evaluatie inhouden. De spatio-temporele informatie die is gecodeerd in een op fluorescentie gebaseerde beeldvormingsmethode zoals in het huidige protocol, zou dus verloren gaan in HPLC en LC-MS en vertegenwoordigt een groot voordeel van op beeldvorming gebaseerde ROS-beoordelingsmethoden. Een bijkomend voordeel van de roodverschoven fluorescentie van DHE is dat de langere golflengte licht (in rood) minder giftig is voor cellen vanwege de lagere energie die door rood licht wordt gedragen.
De dosisafhankelijke aard van DHE-fluorescentie om de relatieve intracellulaire ROS-veranderingen te meten, werd getest met menadion en waterstofperoxide als oxidatieve stressinductoren. Menadion en waterstofperoxide werden als teststoffen gekozen vanwege de variabele mechanismen van ROS en het genereren van oxidatieve stress20,21. Terwijl de ROS-productie als gevolg van blootstelling aan menadion indirect is (door mitochondriale disfunctie), produceert H2O2 oxidatieve stress op een meer directe manier. Toenemende concentraties menadion leidden tot een verhoogde DHE-fluorescentieproductie op een lineaire, herhaalbare en dosisafhankelijke manier. Net als menadion isH2O2 een bekende inductor van ROS die in staat is om hydroxylradicalen (OH) te genereren via Fenton-chemie op een directe manier22. Een lineaire en dosisafhankelijke respons werd op dezelfde manier waargenomen bij DHE-fluorescentie als gevolg van blootstelling aanH2O2. Vanwege de selectiviteit van DHE specifiek voor het superoxideradicaal, reageert het niet direct met de H2O2. In plaats daarvan reageren de geproduceerde intracellulaire superoxideradicalen aanvankelijk met H2O2 om secundaire ROS-soorten te vormen, zoals hydroxyradicalen via de Haber-Weiss- en Fenton-reacties, die vervolgens worden gedetecteerd door DHE-fluorescentie23. Het fluorescentie-emissiespectrum van DHE als reactie op twee verschillende oxiderende stoffen door het grootste deel van de intracellulaire ROS-productie te meten, is vastgesteld in het huidige protocol 8,13. Deze resultaten tonen het nut van fluorescerende DHE-kleurstof aan als een beter alternatief voor de detectie en kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus met behulp van high-throughput screeningbenaderingen.
De superieure selectiviteit, gevoeligheid en optische eigenschappen van DHE maken het een waardevol alternatief voor het onderzoeken van ROS-productie en oxidatieve schade op een high-throughput manier, zoals vastgelegd in het huidige protocol. Toekomstige studies in ons laboratorium zullen de rol van DHE als ROS-marker onderzoeken in de kruisreactiviteit tussen ROS en cellulaire signaleringsmechanismen onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden in een high-throughput setting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.
Acknowledgments
RK en RRG werden ondersteund door een subsidie van het UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) via NIH NIGMS-subsidie P20 GM130422. RRG werd ondersteund door een pilotprijs van de NM-INSPIRES P30-subsidie 1P30ES032755. De ondersteuning van de beeldvormingskern voor het CX7 Cellomics-instrument werd geleverd via de AIM-centrumkernen die werden gefinancierd door NIH-subsidie P20GM121176. We willen Dr. Sharina Desai en Dr. Li Chen bedanken voor hun onschatbare hulp bij technische problemen met betrekking tot het gebruik van het CX7 Cellomics-beeldvormingsplatform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press, Oxford Academic. USA. (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham,, et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
