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Bioengineering

डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) प्रतिदीप्ति डाई का उपयोग करके प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) पीढ़ी का उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग आकलन

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66238
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Pathology, University of New Mexico, 2Department of Chemical and Biological Engineering, University of New Mexico

Summary

यह प्रोटोकॉल एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके प्रतिदीप्ति डाई जांच के रूप में डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को निर्धारित करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल तीन अलग-अलग हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइनों में इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के मात्रात्मक मूल्यांकन के तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में सेलुलर चयापचय के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। शारीरिक आरओएस उत्पादन सामान्य सेलुलर कार्यों जैसे प्रसार, सिग्नलिंग, एपोप्टोसिस और जीर्णता के स्थानिक और लौकिक मॉड्यूलेशन में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। इसके विपरीत, क्रोनिक आरओएस ओवरप्रोडक्शन कैंसर, हृदय रोग और मधुमेह जैसी बीमारियों के व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए जिम्मेदार है। एक सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से आरओएस के स्तर की मात्रा निर्धारित करना इस प्रकार सामान्य सेलुलर कार्यक्षमता को समझने के लिए आवश्यक है। इंट्रा-सेलुलर आरओएस प्रजातियों को चिह्नित करने के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग-आधारित तरीके एक सामान्य दृष्टिकोण है। साहित्य में इमेजिंग आरओएस प्रोटोकॉल में से कई 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) डाई का उपयोग करते हैं। हालांकि, यह डाई इसके उपयोग और व्याख्या में महत्वपूर्ण सीमाओं से ग्रस्त है। वर्तमान प्रोटोकॉल एक उच्च थ्रूपुट सेटिंग में कुल आरओएस उत्पादन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में एक डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग को दर्शाता है। उच्च थ्रूपुट इमेजिंग प्लेटफॉर्म, सीएक्स 7 सेलोमिक्स, का उपयोग आरओएस उत्पादन को मापने और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। यह अध्ययन तीन हेपेटोसेलुलर कैंसर सेल लाइनों - हेपजी 2, जेएचएच 4 और एचयूएच -7 में आयोजित किया गया था। यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं के भीतर आरओएस के मूल्यांकन में शामिल विभिन्न प्रक्रियाओं का गहन विवरण प्रदान करता है, जिसमें शामिल हैं - डीएचई समाधान की तैयारी, डीएचई समाधान के साथ कोशिकाओं का इनक्यूबेशन, और आरओएस उत्पादन को चिह्नित करने के लिए आवश्यक डीएचई तीव्रता का माप। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि डीएचई फ्लोरोसेंट डाई एक उच्च-थ्रूपुट तरीके से इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन को चिह्नित करने के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विकल्प है। आरओएस उत्पादन को मापने के लिए उच्च थ्रूपुट दृष्टिकोण विभिन्न प्रकार के अध्ययनों में सहायक होने की संभावना है, जैसे कि विष विज्ञान, दवा स्क्रीनिंग और कैंसर जीव विज्ञान।

Introduction

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) कोशिकाओं में सामान्य सेलुलर चयापचय के एक भाग के रूप में गठित स्वाभाविक रूप से होने वाली, अत्यधिक प्रतिक्रियाशील और अस्थायी रूप से अस्थिर रासायनिक कणों का एक समूह है। आरओएस कोशिकाओं 1,2 में होने वाली सामान्य शारीरिक और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के मॉडुलन में एक महत्वपूर्ण और आवश्यक भूमिका निभाता है. कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन का मुख्य स्रोत सामान्य बायोएनेरजेटिक चक्र के एक भाग के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन (ईटीसी) मार्ग से है। आरओएस उत्पादन के महत्वपूर्ण अतिरिक्त स्रोतों में कोशिकाओं में सेलुलर एनएडीपीएच ऑक्सीडेस जैसे एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाएं शामिल हैं। खाद्य अणुओं (जैसे, ग्लूकोज) का चयापचय माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण मार्ग के माध्यम से होता है। सामान्य शारीरिक सेल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए आरओएस उत्पादन का आधारभूत स्तर आवश्यक है। कई प्रमुख प्रोटीन अणु जो ग्लूकोज चयापचय सिग्नलिंग मार्ग (जैसे, एटीटी और पीटीईएन) का हिस्सा हैं, इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों का जवाब देने के लिए जाने जाते हैं। इसके अतिरिक्त, आरओएस सेलुलर एंजाइमी एंजाइमों जैसे ज़ैंथिन ऑक्सीडेज, नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ और पेरोक्सिसोमल घटकों द्वारा सेलुलर एंजाइमी मार्ग 1,2 के एक भाग के रूप में निर्मित होते हैं। आरओएस के प्राकृतिक स्रोतों के विपरीत, कुछ पर्यावरणीय कारक, जैसे कि ज़ेनोबायोटिक्स, संक्रामक एजेंट, यूवी प्रकाश, प्रदूषण, सिगरेट धूम्रपान, और विकिरण, आरओएस के अत्यधिक उत्पादन का कारण बनते हैं, जो इंट्रा-सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव 1,3 का एक प्रमुख चालक हैं। ऊंचा सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव ऐसे लिपिड, प्रोटीन, और डीएनए के रूप में एक सेल के अंदर देशी biomolecules को नुकसान हो सकता है, कैंसर, मधुमेह, हृदय रोग, पुरानी सूजन, और neurodegenerative विकारों 1,3,4 के रूप में विभिन्न रोगों के कारण. इसलिए, ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित रोग पैथोफिज़ियोलॉजी में शामिल सेलुलर तंत्र को समझने के लिए आरओएस का सटीक माप आवश्यक है।

आरओएस उत्पादन और कोशिकाओं के अंदर उन्मूलन के कम समय के कारण, विभिन्न आरओएस रेडिकल की मात्रात्मक माप एक चुनौती बनी हुई है। इलेक्ट्रॉन पैरामैग्नेटिक रेजोनेंस (ईपीआर)5, हाई-प्रेशर लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी), और फ्लोरेसेंस प्रोब-आधारित इमेजिंग जैसे तरीकों का उपयोग विभिन्न सेलुलर आरओएस6को मापने के लिए किया जाता है। जबकि ईपीआर और एचपीएलसी जैसे तरीके मात्रात्मक रूप से सटीक अनुमान देते हैं, इन विधियों में सेलुलर स्थानिक आकृति विज्ञान का विनाश शामिल है और आमतौर पर एक नमूने के वैश्विक और थोक माप के रूप में होते हैं। इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति जांच-आधारित विधियों जैसे इमेजिंग-आधारित विधियां सेलुलर आकृति विज्ञान और आरओएस पीढ़ी के स्थानिक संदर्भ को बनाए रखती हैं। हालांकि, आरओएस कट्टरपंथियों के विभिन्न प्रकार के लिए विभिन्न प्रतिदीप्ति जांच की विशिष्टता अच्छी तरह से 7,8 स्थापित नहीं किया गया है. डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई), डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए), डायहाइड्रोरोडामाइन (डीएचआर), डाइमिथाइल एन्थ्रेसीन (डीएमए), 2,7 डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन (डीसीएफएच), 1,3-डिफेनिलिसोबेंजोफुरन (डीपीबीएफ), और मिटोसॉक्स जैसे कई फ्लोरोसेंट जांच व्यावसायिक रूप से आरओएस का पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं। पिछले दशकों में, डीएचई, मिटोसॉक्स और डीसीएफएच-डीए कोशिकाओं और ऊतकों 8,9में आरओएस को मापने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले फ्लोरोसेंट रंजक हैं। डीसीएफएच-डीए इंट्रासेल्युलर एच2ओ2 और ऑक्सीडेटिव तनाव का पता लगाने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली डाई है। डीसीएफएच-डीए की लोकप्रियता के बावजूद, पिछले कई अध्ययनों से पता चला है कि इसका उपयोग इंट्रासेल्युलरएच 2ओ2 और अन्य आरओएस स्तरों 8,9,10,11,12,13,14को मापने के लिए मज़बूती से नहीं किया जा सकता है।

इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट जांच डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) इंट्रा-सेलुलर सुपरऑक्साइड रेडिकल (ओ2-) के लिए एक विशिष्ट प्रतिक्रिया दिखाती है। जबकि सुपरऑक्साइड रेडिकल कोशिकाओं में देखी जाने वाली कई आरओएस प्रजातियों में से एक है, यह अन्य इंट्रासेल्युलर प्रभावों के बीच संक्रमण धातुओं की कमी, पेरोक्सीनाइट्रेट में रूपांतरण और हाइड्रोपरॉक्साइड के गठन में शामिल एक महत्वपूर्ण कट्टरपंथी है। डीएचई जल्दी से कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है और लाल तरंग दैर्ध्य रेंज15 में एक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन है. विशेष रूप से सुपरऑक्साइड रेडिकल के साथ प्रतिक्रिया करने पर, डीएचई एक लाल फ्लोरोसेंट उत्पाद, 2-हाइड्रॉक्सी एथिडियम (2-ओएच-ई +) बनाता है। इस प्रकार, डीएचई को सुपरऑक्साइड का पता लगाने के लिए एक विशिष्ट जांच के रूप में माना जा सकता है। हालांकि, डीएचई ओएनओओ- या ओएच, एच2ओ2, और साइटोक्रोम सी के साथ एक दूसरे प्रतिदीप्ति उत्पाद, एथिडियम ई + बनाने के लिए गैर-विशिष्ट ऑक्सीकरण से भी गुजर सकता है, जो मापा 2-ओएच-ई + स्तरों में हस्तक्षेप कर सकता है। हालांकि, ये 2-ओएच ई + और ई + उत्पाद, संयोजन में, डीएचई के साथ दाग होने पर सेल के अंदर देखी गई कुल सेलुलर आरओएस प्रजातियों के एक प्रमुख हिस्से का प्रतिनिधित्व करते हैं। ई + डीएनए में intercalates, बहुत इसकी प्रतिदीप्ति 8,9,10,11,13,14,15,16 बढ़ाने. चूंकि एथिडियम और 2-हाइड्रॉक्सी एथिडियम के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा केवल थोड़ा भिन्न होते हैं, इसलिए सुपरऑक्साइड उत्पादन के लिए सेल माध्यमिक में देखे गए आरओएस स्तरों के बहुमत का पता लगाया जा सकता है और डीएचई प्रतिदीप्ति उत्पादों का उपयोग करके मापा जा सकता है। इन आरओएस प्रजातियों की पहचान 480 एनएम तरंग दैर्ध्य उत्तेजना और 610 एनएम तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन 15,16,17का उपयोग करके की जाती है।

एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट आरओएस डिटेक्शन जांच चुनने के अलावा, इंट्रासेल्युलर आरओएस को मापने के लिए पता लगाने की एक संवेदनशील विधि चुनना महत्वपूर्ण है। इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों का सटीक मूल्यांकन इस प्रकार रोगग्रस्त कोशिकाओं या कोशिकाओं में होने वाली परेशान रेडॉक्स संतुलन राज्यों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है जो विकिरण, विषैले यौगिकों और जीनोटॉक्सिक एजेंटों जैसे विभिन्न पर्यावरणीय तनावों के संपर्क मेंहैं18. चूंकि आरओएस कोशिकाओं में आमतौर पर होने वाली घटना है जो विभिन्न प्रकार की सेल सिग्नलिंग गतिविधियों को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार है, आरओएस का पता लगाने के मजबूत तरीके आवश्यक हैं। कोशिकाओं के भीतर आरओएस उत्पादन के इस तरह के उच्च-थ्रूपुट मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए, यह प्रोटोकॉल आरओएस प्रजातियों को मापने के लिए एक उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) मंच का उपयोग करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति देता है, जो कई विष विज्ञानअध्ययनों19में महत्वपूर्ण महत्व का है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य पक्षपाती हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर आरओएस का पता लगाने और मापने के लिए एक आसान और बहुमुखी समाधान प्रदान करना है। एच2ओ2 और मेनाडियोन के रासायनिक अभिकर्मकों को नियंत्रित और उच्च थ्रूपुट सेटिंग में आरओएस उत्पादन के सापेक्ष स्तर को मापने के लिए शक्तिशाली आरओएस उत्तेजक के रूप में उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल को आवश्यकतानुसार उपयुक्त परिस्थितियों में पक्षपाती और गैर-पक्षपाती कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन को मापने के लिए ठीक किया जा सकता है।

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. परीक्षण कोशिकाओं (हेपजी 2, एचयूएच 7, और जेएचएच 4 हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं) को 96-अच्छी प्लेट में 10,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 200 माइक्रोन प्रति कुएं की अंतिम बीजारोपण मात्रा में बीज दें।
    1. हेपजी 2 कोशिकाओं की खेती करने से पहले, कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 घंटे की अवधि के लिए टाइप IV कोलेजन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ 96 प्लेट कुओं को कोट करें। स्टॉक कोलेजन के जमने से बचने के लिए, स्टॉक समाधान को बर्फ में रखें और बाद में, वांछित एकाग्रता के लिए कमजोर पड़ने की प्रक्रिया शुरू करें।
    2. 2 घंटे इनक्यूबेशन अवधि के बाद, अतिरिक्त कोलेजन को एस्पिरेट करें और कुओं को 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  2. Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में कोशिकाओं को रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस और एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 एकाग्रता पर खेती करें।
  3. अगले दिन, या 80% -90% संगम तक पहुंचने पर, जो भी पहले हो, एच2ओ2 (अनुपचारित, 250 माइक्रोन, 500 माइक्रोन, 750 माइक्रोन, और 1000 माइक्रोन) और मेनाडियोन (अनुपचारित, 25 माइक्रोन, 50 माइक्रोन, 75 माइक्रोन, 100 माइक्रोन) के साथ कोशिकाओं का इलाज क्रमशः 30 मिनट के लिए प्रतिनिधि ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करने के लिए।
  4. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं के भीतर ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करने में सक्षम पसंद के वांछित परीक्षण पदार्थ के साथ कोशिकाओं का परीक्षण करना चुनें।

2. कोशिकाओं के डीएचई धुंधला के लिए स्टॉक और पतला समाधान तैयारी

  1. डीएचई स्टॉक समाधान (5 मिलीग्राम/एमएल या 15.9 मिमी) डीएमएसओ के 1 एमएल में डीएचई के 5 मिलीग्राम को भंग करके तैयार करें।
  2. एक अंतिम 100 माइक्रोन एकाग्रता के लिए डबल आसुत autoclaved पानी के साथ डीएचई शेयर समाधान पतला.
  3. डाई की फ्रीज और पिघलना प्रक्रिया से बचने के लिए (जो समय के साथ प्रतिदीप्ति गुणों को नुकसान पहुंचा सकता है), 100 माइक्रोन की एकाग्रता के साथ 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में कई एलिकोट तैयार करें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 10 माइक्रोन की अंतिम कामकाजी एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, 100 माइक्रोन डीएचई एकाग्रता के विभाज्य का उपयोग करें और इसे पूर्व-गर्म डीएमईएम मीडिया के साथ पतला करें।
    नोट: काम समाधान प्रयोग के दिन नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए।
  5. भंवर डाई के उचित मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए 5-10 एस के लिए काम कर रहे प्रतिदीप्ति डाई समाधान।

3. डीएचई धुंधला प्रक्रिया

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से दवा या परीक्षण पदार्थ युक्त मीडिया निकालें और इसे धीरे से या तो 1x पीबीएस या DMEM के साथ एक बार धोने.
    नोट: प्रयोग में इसके अलावा या धोने के चरणों का प्रदर्शन करते समय, कोशिकाओं और पिपेटर के बीच सीधे संपर्क से बचना महत्वपूर्ण है। यह धीरे कुओं के किनारों के साथ पीबीएस pipeting कोशिकाओं के लिए किसी भी संभावित यांत्रिक क्षति को कम करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. यह सुनिश्चित करना कि पिपेटेटर सीधे कोशिकाओं को स्पर्श नहीं करता है, प्रयोग की अवधि के लिए सेल अखंडता और व्यवहार्यता को बनाए रखने में मदद करेगा।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से में 10 माइक्रोन डीएचई (काम कर रहे समाधान) युक्त डीएमईएम मीडिया के 100 माइक्रोन जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. 30 मिनट इनक्यूबेशन अवधि के बाद, डीएचई युक्त मीडिया को हटा दें और प्रत्येक अच्छी तरह से धीरे से 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ तीन बार धो लें। यह तेजी से बदलाव सुनिश्चित करने के लिए एक मल्टी-चैनल पिपटेटर के साथ किया जा सकता है।
  4. आरटी पर 10 मिनट के लिए Hoechst 33342 परमाणु धुंधला डाई के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से 1x पीबीएस के 200 माइक्रोन जोड़ें।
  5. कुएं से Hoechst 33342 परमाणु धुंधला समाधान निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से 1x पीबीएस के 200 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: निश्चित कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, उपचार और डीएचई धुंधला होने के बाद 5 मिनट के लिए 4% पीएफए जोड़ने के एक अतिरिक्त कदम के साथ, जीवित कोशिकाओं के लिए एक ही प्रोटोकॉल का पालन करें। पीएफए समाधान निकालें और 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। फिर, 10 मिनट के लिए परमाणु धुंधला डाई के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  6. जितनी जल्दी हो सके छवि अधिग्रहण के लिए उच्च सामग्री स्क्रीनिंग मंच, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, या प्लेट रीडर पर थाली ले जाएँ.

4. छवि अधिग्रहण और तीव्रता माप

  1. प्लेट लोड हो रहा है
    1. डेटा अधिग्रहण के लिए Cellomics CX7 उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (HCS) सॉफ़्टवेयर खोलें।
    2. ध्यान से डेटा में किसी भी धुंधला या धुंधली छवियों से बचने के लिए उपयोग के लिए पसंद की विशिष्ट 96 अच्छी तरह से थाली के साथ समय से पहले निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार इमेजिंग मंच जांचना.
      नोट: विभिन्न विक्रेताओं से मल्टी-वेल प्लेटों में अलग-अलग भौतिक गुण हो सकते हैं और प्राप्त अंतिम छवियों की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं।
    3. एक बार कैलिब्रेट होने के बाद, इंस्ट्रूमेंट डेटाबेस में प्लेट ब्रांड के लिए विशिष्ट सिस्टम पैरामीटर को बचाएं और भविष्य के डेटा अधिग्रहण के लिए उनका पुन: उपयोग करें।
    4. ध्यान से एचसीएस इमेजिंग सिस्टम के गर्म चरण पर तैयार नमूनों के साथ थाली जगह है. सुनिश्चित करें कि प्लेट सुरक्षित रूप से स्थित है और माइक्रोप्लेट धारक पर इमेजिंग के लिए सही अभिविन्यास में है (यानी, रीडर स्टेज पर A1 चिह्नित लेबल का पता लगाएं, फिर माइक्रोप्लेट को घुमाएं ताकि अच्छी तरह से A1 का स्थान स्टिकर के साथ कोने से मेल खाता हो)।
    5. माइक्रोप्लेट पर धीरे से दबाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह मंच के खिलाफ सपाट है। एचसीएस प्रणाली में प्लेट के असमान स्तर से छवि अधिग्रहण में त्रुटियां हो सकती हैं।
    6. प्लेट लगने के बाद, Ctrl कुंजी को दबाकर रखें, फिर क्लिक करें Ctrl-OK में प्लेट लोड/अनलोड सॉफ्टवेयर में संवाद।
  2. इमेजिंग पैरामीटर का चयन करना
    1. एचसीएस इमेजिंग सिस्टम में, सेलोमिक्स जैव-अनुप्रयोग इंटरफ़ेस में लक्ष्य सक्रियण मोड खोलें और (ए) परमाणु धुंधला और (बी) डीएचई प्रतिदीप्ति जांच डेटा अधिग्रहण के साथ संगत दो-चैनल सेटअप प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक नया प्रोटोकॉल बनाएं। वर्तमान प्रोटोकॉल में, फिल्टर 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS, और 386_BGS_RS क्रमशः (ए) होचस्ट 33342 परमाणु-धुंधला, (बी) कुल आरओएस उत्पादन, और (सी) सुपरऑक्साइड कट्टरपंथी पता लगाने के लिए उपयोग किया गया था। इन फिल्टर की पसंद प्रत्येक रंजक (DAPI और DHE) इस प्रोटोकॉल का एक भाग के रूप में इस्तेमाल के उत्सर्जन गुणों के लिए विशिष्ट ओवरलैप द्वारा संचालित किया गया था.
      नोट: फिल्टर का नामकरण सम्मेलन, उदाहरण के लिए, 386-23_BGRFRN_BGRFRN, 23 एनएम बैंडविड्थ के साथ 386 एनएम प्रकाश के साथ नमूने की उत्तेजना को संदर्भित करता है, इसके बाद एक डाइक्रोइक फिल्टर होता है जो नीला (बी), हरा (जी), लाल (आर), दूर-लाल (एफआर), और विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर्वतमाला पर इन्फ्रा-रेड (एन) प्रकाश के पास होता है और 386_BGS_RS एक उत्सर्जन फिल्टर को संदर्भित करता है जो डाइक्रोइक के बाद बीजीएस और आरएस उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य प्रकाश से गुजरता है।
    2. सॉफ़्टवेयर प्रोटोकॉल इंटरफ़ेस के भीतर छवि अधिग्रहण प्रक्रिया के उद्देश्यों को निर्दिष्ट करें, जैसे कि आवश्यकतानुसार 10x या 20x आवर्धन।
    3. इमेजिंग विस्तार और प्रयोग के लिए आवश्यक संकल्प के वांछित स्तर के आधार पर उपयुक्त उद्देश्य बढ़ाई चुनें. हालाँकि, प्रत्येक उद्देश्य का संकल्प निश्चित है। उच्च रिज़ॉल्यूशन विवरण के लिए प्लेटफ़ॉर्म पर उद्देश्य को बदलने की आवश्यकता होगी। वर्तमान प्रोटोकॉल में, एक 20x, 0.45 NA उद्देश्य का उपयोग किया जाता है, जो इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म का एक हिस्सा है।
      नोट: 20x उद्देश्य इमेजिंग संकल्प विस्तार और समय के साथ आरओएस परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए आवश्यक अधिग्रहण की गति के बीच एक अच्छा व्यापार बंद का प्रतिनिधित्व करता है. उच्च आवर्धन उद्देश्यों (जैसे, 40X) चुना जा सकता है, हालांकि, इससे अधिग्रहण के समय में वृद्धि होगी।
    4. प्रोटोकॉल की विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार छवि अधिग्रहण कैमरे की एक्सपोज़र सेटिंग्स निर्दिष्ट करें, जैसे एक्सपोज़र समय, कैमरा बिनिंग और z-स्टैक अंतराल।
      नोट: एक्सपोज़र समय (अक्सर मिलीसेकंड में) सिग्नल की शक्ति और उपयोग किए गए विशिष्ट फ्लोरोफोर्स की संवेदनशीलता के आधार पर भिन्न होता है। यह डाई एकाग्रता और धुंधला गुणवत्ता के आधार पर प्रयोग करने के लिए प्रयोग से थोड़ा अलग हो सकता है. वर्तमान प्रोटोकॉल में, अधिग्रहण के पैरामीटर निम्नानुसार तय किए गए हैं - लक्ष्य% - 35%, छवि अधिग्रहण मोड - 1104 x 1104 (2x2 बिनिंग के साथ), और उद्देश्य 20x, 0.45 एनए। इन मापदंडों को विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों के अनुसार सेट किया जा सकता है।
  3. इमेजिंग कॉन्फ़िगरेशन पैरामीटर
    नोट: एक बार इमेजिंग पैरामीटर सेट हो जाने के बाद, छवि संग्रह प्रक्रिया सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस का उपयोग करके शुरू की जा सकती है।
    1. छवि संग्रह पैरामीटर
      1. साधन में उपलब्ध विभिन्न एल्गोरिदम (प्रकाशिकी - आइसोडाटा, निश्चित और त्रिकोण) का उपयोग करके ब्याज की प्राथमिक ट्रैकिंग वस्तु (कोशिकाओं के नाभिक) की पहचान करें।
        नोट: प्राथमिक वस्तु की पहचान और अंकन के लिए आइसोडेटा विधि का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया जाता है।
      2. ऑब्जेक्ट (यदि कोई हो) को आकार या तीव्रता पैरामीटर द्वारा विभाजित करें।
      3. प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अद्वितीय वांछित आकार, आकार और तीव्रता मापदंडों के आधार पर प्राथमिक वस्तु को मान्य करें।
      4. फिर, इस प्राथमिक वस्तु के आसपास 'रुचि का क्षेत्र' (आरओआई) परिभाषित करें।
        नोट: आरओआई डेटा अधिग्रहण का एक प्रमुख पैरामीटर है जो उस स्थान को परिभाषित करता है जहां प्रतिदीप्ति डाई की तीव्रता को सेल प्रकारों में सुसंगत और दोहराने योग्य माना जाता है। आरओआई प्रमुख मापदंडों (जैसे डाई की तीव्रता) को परिभाषित करता है, जो उपकरण के विभिन्न चैनलों में प्रत्येक प्राथमिक ट्रैकिंग ऑब्जेक्ट (यानी, एक सेल) के लिए मापा जाता है। आरओआई को प्रत्येक कोशिका के नाभिक के चारों ओर एक सर्कल या रिंग के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। एचसीएस सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से प्रत्येक सेल के लिए आरओआई की सीमा के भीतर चैनल 2 में डीएचई प्रतिदीप्ति डाई मार्कर की तीव्रता प्राप्त करता है जिसे स्वचालित तरीके से खंडित और विश्लेषण किया जाता है।
      5. प्राथमिक वस्तु (नाभिक) के चारों ओर एक 20 माइक्रोन सर्कल सेट करें। इस प्रोटोकॉल (हेपजी 2, जेएचएच -4, और एचयूएच -7) में उपयोग की जाने वाली विभिन्न सेल लाइनों के अनुमानित आकार के आधार पर इस अध्ययन में 20 माइक्रोन की दूरी को चुना गया था। कोशिकाओं के चारों ओर 20 माइक्रोन अंगूठी आरओआई एक सुसंगत और दोहराने योग्य तरीके से प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त की।
        नोट: आरओआई चुनने में महत्वपूर्ण पैरामीटर सेल क्षेत्र को पर्याप्त रूप से कवर करने की क्षमता है; परिपत्र आरओआई का आकार सेल आकार पर निर्भर करता है। बड़ी कोशिकाओं को बड़े ROI की आवश्यकता हो सकती है और छोटे ROI के लिए इसके विपरीत। इन मापदंडों को प्रत्येक सेल प्रकार और ब्याज की प्रतिदीप्ति डाई के लिए समय से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए।
  4. जनसंख्या लक्षण वर्णन और स्टोर करने के लिए सुविधाओं का चयन करें
    1. एचसीएस इमेजिंग प्रोटोकॉल में विभिन्न अधिग्रहण मापदंडों को परिभाषित करने के बाद, एचसीएस सिस्टम को डेटा अधिग्रहण मोड में सेट करें।
    2. इस प्रोटोकॉल के लिए छवि अधिग्रहण मापदंडों को निम्नानुसार सेट किया गया था: प्रति क्षेत्र 10 वस्तुओं (कोशिकाओं) की न्यूनतम आवश्यकता के साथ 1000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से स्कैन सीमा।
      नोट: प्रत्येक कुएं के लिए मूल्यांकन किए गए क्षेत्रों की संख्या अंतिम सेल गिनती 1000 तक पहुंचने के आधार पर निर्धारित की गई थी। एचसीएस प्रणाली कुएं के भीतर विभिन्न स्थानों की खोज जारी रखती है जब तक कि यह 1000 कोशिकाओं / अधिग्रहण की गति इस प्रकार संगम और 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में मौजूद कुल सेल संख्या पर निर्भर करता है. वर्तमान प्रोटोकॉल में, चैनल 2 की कुल और औसत तीव्रता (सुपरऑक्साइड रेडिकल और कुल आरओएस उत्पादन का प्रतिनिधित्व) आगे बहाव विश्लेषण के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से एकत्र किए गए थे।
  5. छवि कैप्चर, प्रसंस्करण और विश्लेषण
    1. समायोजित करने और छवि अधिग्रहण मापदंडों को अंतिम रूप देने के बाद, प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए स्कैनिंग प्रक्रिया शुरू.
      नोट: सेलोमिक्स सीएक्स 7 इमेजिंग सिस्टम उच्च-थ्रूपुट तरीके से कोशिकाओं के भीतर आरओएस उत्पादन सहित विभिन्न मापदंडों के नमूनों के उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग और स्वचालित विश्लेषण को सक्षम बनाता है। आरओएस उत्पादन के अलावा, एचसीएस प्रणाली सेल आकृति विज्ञान, उपकोशिकीय स्थानीयकरण, और ब्याज की कई अन्य सेलुलर सुविधाओं जैसे विभिन्न मापदंडों के बारे में अतिरिक्त मूल्यवान जानकारी प्रदान करने में सक्षम है। एक बार अधिग्रहण के लिए अनुकूलित, एचसीएस इमेजिंग मंच एक मजबूत तरीके से सेल मापदंडों के व्यापक, गुणात्मक और मात्रात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है।
    2. स्कैनिंग प्रक्रिया पूरी होने के बाद, व्यू एनालिसिस सॉफ्टवेयर लॉन्च करें और अतिरिक्त विश्लेषण के लिए विभिन्न मात्रात्मक डेटा मापदंडों को .csv प्रारूप में निर्यात करें।
    3. तृतीय-पक्ष सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, अतिरिक्त डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए ब्याज के विभिन्न मात्रात्मक मूल्यों को कॉपी और पेस्ट करें।
      नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में, ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर का उपयोग एच2ओ2 और मेनाडियोन एक्सपोजर के कारण प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के जवाब में डीएचई तीव्रता मूल्यों का विश्लेषण करने के लिए किया गया था।
  6. डेटा और सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. चैनल 2 की औसत औसत तीव्रता की गणना करें (कुल आरओएस मूल्यों और सुपरऑक्साइड रेडिकल का प्रतिनिधित्व करते हुए)।
      नोट: तीव्रता मूल्यों की गणना करने के लिए सभी प्रयोगों को प्रत्येक खुराक स्तर पर प्रति स्थिति 6 प्रतिकृति के साथ तीन बार दोहराया गया था।
    2. विभिन्न परीक्षण स्थितियों के बीच तीव्रता मूल्यों में अंतर को मापने के लिए एक तरफा एनोवा या टी-परीक्षण करें।

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Representative Results

डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) एक सुपरऑक्साइड-उत्तरदायी प्रतिदीप्ति डाई है जो इंट्रासेल्युलर आरओएस राज्यों के बारे में विशिष्ट जानकारी प्रदान करता है। डीएचई डाई आंतरिक रूप से साइटोप्लाज्म में नीले प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है। हालांकि, सुपरऑक्साइड रेडिकल के साथ बातचीत करने पर, यह 2-हाइड्रॉक्सीथिडियम में बदल जाता है, जो लाल तरंग दैर्ध्य (>550 एनएम)(चित्रा 1)में प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है। डीएचई डाई को आसानी से कोशिकाओं और नाभिक में ले जाया जाता है। उत्सर्जित प्रतिदीप्ति आमतौर पर कई प्रयोगशालाओं में उपलब्ध एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सेटअप के साथ कल्पना की जा सकती है. वर्तमान अध्ययन में, आरओएस प्रजातियों की पीढ़ी की जांच के रूप में कई हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइनों - एचयूएच 7, जेएचएच 4, और हेपजी 2 कोशिकाओं पर डीएचई डाई की उपयोगिता का परीक्षण उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म पर किया गया था। कोशिकाओं को दो आरओएस पैदा करने वाले एजेंटों के साथ इलाज किया गया था - (ए) हाइड्रोजन पेरोक्साइड और (बी) खुराक पर निर्भर तरीके से 30 मिनट के लिए मेनाडियोन (खुराक विवरण के लिए चित्रा 2 और चित्रा 3 देखें) कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करने के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट में डीएचई डाई लेबलिंग। एच2ओ2 और मेनाडियोन दोनों ने खुराक पर निर्भर तरीके से सभी तीन सेल लाइनों में नाटकीय रूप से प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि की। उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म के भीतर छवि विभाजन और परिमाणीकरण एल्गोरिदम का उपयोग करते हुए, आरओएस प्रेरित डीएचई प्रतिदीप्ति की तीव्रता को छह प्रतिकृतियों में प्रति अच्छी तरह से 1000 कोशिकाओं में मात्रा निर्धारित की गई थी। तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियों को मापा गया, और परिणामों को एकत्रित और विश्लेषण किया गया। Hoechst 33342 परमाणु दाग उस विमान की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जिसमें प्रत्येक कुएं में पक्षपाती कोशिकाएं मौजूद होती हैं। इसके अतिरिक्त, 2-ओएच-ई + और ई + प्रतिदीप्ति को क्रमशः उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म पर परीक्षण कोशिकाओं के नाभिक और साइटोप्लाज्म दोनों में पाया जा सकता है ( चित्र 4 देखें)।

एच2ओ2 के एक्सपोजर के परिणामस्वरूप खुराक पर निर्भर तरीके से विश्लेषण की गई सभी सेल लाइनों में आरओएस प्रेरित प्रतिदीप्ति की सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि हुई ( चित्र 2 देखें; निचला पैनल)। हालांकि, मेनाडियोन एक्सपोजर के मामले में इस तरह की खुराक पर निर्भर प्रतिक्रिया नहीं देखी गई थी। मेनाडियोन के साथ, जेएचएच 4 सेल लाइन ने फ्लोरोसेंट तीव्रता में खुराक पर निर्भर वृद्धि दिखाई, जबकि हेपजी 2 और एचयूएच 7 सेल लाइनों में, प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक महत्वपूर्ण अंतर केवल उच्च मेनाडियोन सांद्रता पर देखा गया था ( चित्र 3 देखें; निचला पैनल)। आरओएस पीढ़ी प्रतिक्रियाओं में ये अंतर एच2ओ2 और मेनाडियोन के आरओएस उत्पादन के अलग-अलग तंत्र के कारण हो सकते हैं। जबकि एच2ओ2 कोशिकाओं में आरओएस गठन को अधिक प्रत्यक्ष तरीके से ट्रिगर करता है (उदाहरण के लिए, एंटीऑक्सिडेंट एंजाइमों जैसे पेरोक्सीडेस और कैटलस की कार्रवाई के माध्यम से), मेनाडियोन को प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के माध्यम से अप्रत्यक्ष तरीके से आरओएस प्रजातियों को उत्पन्न करने के लिए परिकल्पना की जाती है। आरओएस उत्पादन के अप्रत्यक्ष तंत्र के कारण, डीएचई प्रतिदीप्ति को मेनाडियोन के साथ प्रकट होने के लिए अधिक समय की आवश्यकता हो सकती है। इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि आरओएस पर निर्भर डीएचई प्रतिदीप्ति ऑक्सीडेटिव तनाव जोखिम, एकाग्रता और सेल प्रकारों की अवधि के प्रति संवेदनशील है। प्रत्येक अद्वितीय सेल प्रकार के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का अनुकूलन इस प्रकार एक जरूरी है. इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि यह प्रोटोकॉल डीएचई डाई के उपयोग की व्यवहार्यता को आरओएस डिटेक्शन एजेंट के रूप में उच्च-थ्रूपुट तरीके से प्रदर्शित करता है, जो विष विज्ञान, कैंसर जीव विज्ञान और ड्रग स्क्रीनिंग जैसे क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: क्रमशः 2-हाइड्रॉक्सीथिडियम (2-ओएच-ई +) और एथिडियम (ई +) में डीएचई प्रतिदीप्ति अणु के ऑक्सीडेटिव रूपांतरण के मार्गों को दर्शाने वाला एक योजनाबद्ध। 2-OH-E+ और E+ का प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा 480 एनएम की उत्तेजना पर ओवरलैप होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार खुराक पर निर्भर तरीके से इंट्रासेल्युलर आरओएस के स्तर को बढ़ाता है। हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं - (ए) एचयूएच 7, (बी) जेएचएच 4, और (सी) हेपजी 2 को 30 मिनट की अवधि के लिए 250 माइक्रोन, 500 माइक्रोन, 750 माइक्रोन और 1000 माइक्रोन की खुराक पर एच2ओ2 के साथ इलाज किया गया था। कोशिकाओं को अतिरिक्त 30 मिनट के लिए संस्कृति मीडिया में डीएचई (10 माइक्रोन) डाई के साथ दाग दिया गया था, इसके बाद होचस्ट 33342 परमाणु धुंधला हो गया था। प्रत्येक कुएं में कुल 1000 कोशिकाओं की गिनती की गई। डीएचई प्रतिदीप्ति में एक रैखिक, खुराक पर निर्भर वृद्धि सभी तीन सेल लाइनों (शीर्ष पैनल) में देखी जाती है। प्रतिदीप्ति में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि 500 माइक्रोन और ऊपर (नीचे पैनल) खुराक के लिए सभी सेल लाइनों में देखा जाता है. प्रत्येक डेटासेट तीन स्वतंत्र प्रयोगों (एन = 3) से प्राप्त 96-अच्छी प्लेट में औसतन छह प्रतिकृतियां हैं। उपचार की स्थिति एक तरह से एनोवा परीक्षण (**** - पी < 0.0001, *** - पी < 0.001; छवि पैमाने पट्टी - 50 माइक्रोन) का उपयोग कर अनुपचारित नमूनों की तुलना में थे .

Figure 3
चित्रा 3: मेनाडियोन उपचार खुराक पर निर्भर तरीके से इंट्रासेल्युलर आरओएस के स्तर को बढ़ाता है। हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं - (ए) एचयूएच 7, (बी) जेएचएच 4, और (सी) हेपजी 2 को 30 मिनट की अवधि के लिए 25 माइक्रोन, 50 माइक्रोन, 75 माइक्रोन और 100 माइक्रोन की खुराक पर मेनाडियोन के साथ इलाज किया गया था। कोशिकाओं को अतिरिक्त 30 मिनट के लिए संस्कृति मीडिया में डीएचई (10 माइक्रोन) डाई के साथ दाग दिया गया था, इसके बाद होचस्ट 33342 परमाणु धुंधला हो गया था। प्रत्येक कुएं में कुल 1000 कोशिकाओं की गिनती की गई। डीएचई प्रतिदीप्ति में एक रैखिक, खुराक पर निर्भर वृद्धि सभी तीन सेल लाइनों (शीर्ष पैनल) में देखी जाती है। प्रतिदीप्ति में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि अधिकतम खुराक (100 माइक्रोन; नीचे पैनल) के लिए लगातार देखा जाता है। विभिन्न सेल लाइनों (JHH4 > HUH7 > HepG2) में मेनाडियोन की शेष खुराक के लिए परिवर्तनशीलता देखी जाती है। प्रत्येक डेटासेट तीन स्वतंत्र प्रयोगों (एन = 3) से प्राप्त 96-अच्छी प्लेट में औसतन छह प्रतिकृतियां हैं। उपचार की स्थिति एक तरह से एनोवा परीक्षण (**** - पी < 0.0001, *** - पी < 0.001; छवि पैमाने पट्टी - 50 माइक्रोन) का उपयोग कर अनुपचारित नमूनों की तुलना में थे .

Figure 4
चित्रा 4: एकल कोशिका डीएचई प्रतिदीप्ति - 30 मिनट की अवधि के लिए (ए) हाइड्रोजन पेरोक्साइड और (बी) मेनाडियोन के साथ उपचार के बाद देखे गए डीएचई प्रतिदीप्ति परिवर्तनों का एक क्लोज-अप दृश्य। डीएचई प्रतिदीप्ति के साइटोप्लाज्मिक और परमाणु परिवर्तन विभिन्न कोशिकाओं में देखे जाते हैं। उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म द्वारा उत्पन्न स्वचालित विभाजन मुखौटा भी देखा जाता है। छवि स्केल बार - 10 माइक्रोन। आवर्धन - 20x। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 1: हाइड्रोजन पेरोक्साइड के जवाब में इमेजिंग सुपरऑक्साइड संचालित डीएचई प्रतिदीप्ति। हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं - (ए) एचयूएच 7, (बी) जेएचएच 4, और (सी) हेपजी 2 को 30 मिनट की अवधि के लिए 250 माइक्रोन, 500 माइक्रोन, 750 माइक्रोन और 1000 माइक्रोन की खुराक पर एच2ओ2 के साथ इलाज किया गया था। कोशिकाओं को तब अतिरिक्त 30 मिनट के लिए संस्कृति मीडिया में डीएचई (10 माइक्रोन) डाई के साथ दाग दिया गया था। इसके बाद, कोशिकाओं को 386 एनएम एलईडी के साथ रोशन किया गया था, और प्रतिदीप्ति इमेजिंग >560 एनएम पर एकत्र की गई थी। वर्णक्रमीय क्रॉस-टॉक से बचने के लिए कोई परमाणु काउंटरस्टेनिंग नहीं किया गया था। डीएचई प्रतिदीप्ति में खुराक पर निर्भर वृद्धि 500 माइक्रोन > खुराक पर देखी जाती है। यूवी-प्रबुद्ध डीएचई प्रतिदीप्ति सुपरऑक्साइड कट्टरपंथी उत्पादन के बहुमत के कारण होने की उम्मीद है। प्रत्येक डेटासेट दो स्वतंत्र प्रयोगों (एन = 2) से प्राप्त 96-अच्छी प्लेट में छह प्रतिकृतियों का औसत है। उपचार की स्थिति एक एक तरह से एनोवा (**** - पी < 0.0001, *** - पी < 0.001; छवि पैमाने पट्टी - 50 माइक्रोन) का उपयोग कर अनुपचारित नमूनों की तुलना में थे .

अनुपूरक चित्रा 2: मेनाडियोन के जवाब में इमेजिंग सुपरऑक्साइड संचालित डीएचई प्रतिदीप्ति - हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं - (ए) एचयूएच 7, (बी) जेएचएच 4, और (सी) हेपजी 2 को 30 मिनट की अवधि के लिए 25 माइक्रोन, 50 माइक्रोन, 75 माइक्रोन और 100 माइक्रोन की खुराक पर मेनाडियोन के साथ इलाज किया गया था। कोशिकाओं को तब अतिरिक्त 30 मिनट के लिए संस्कृति मीडिया में डीएचई (10 माइक्रोन) डाई के साथ दाग दिया गया था। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के समान, डीएचई प्रतिदीप्ति में खुराक पर निर्भर वृद्धि देखी गई। प्रत्येक डेटासेट दो स्वतंत्र प्रयोगों (एन = 2) से प्राप्त 96-अच्छी प्लेट में छह प्रतिकृतियों का औसत है। उपचार की स्थिति एक एक तरह से एनोवा (**** - पी < 0.0001, *** - पी < 0.001; छवि पैमाने पट्टी - 50 माइक्रोन) का उपयोग कर अनुपचारित नमूनों की तुलना में थे .

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Discussion

इस अध्ययन में, डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) प्रतिदीप्ति डाई का उपयोग करके सुपरऑक्साइड-संचालित इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल एक उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग सिस्टम पर स्थापित किया गया था। साहित्य में उपलब्ध वर्तमान प्रोटोकॉल का एक बहुमत डीसीएफएच-डीए आरओएस प्रजातियों यों यों के लिए एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग जांच के रूप में उपयोग करें. हालांकि, कई अध्ययनों से पता चला है कि डीसीएफएच-डीए इंट्रासेल्युलर आरओएस के माप के लिए एक आदर्श जांच नहीं है। जांच के रूप में डीसीएफएच-डीए की अनुपयुक्तता के लिए पोस्ट किए गए विभिन्न कारणों में शामिल हैं - (i) डीसीएफएच-डीए एच2ओ2 के साथ सीधी प्रतिक्रिया प्रदर्शित नहीं करता है, जो इसे इंट्रासेल्युलर एच2ओ2 स्तर के मूल्यांकन के लिए एक अनुचित डाई बनाता है। (ii) कई एक-इलेक्ट्रॉन ऑक्सीकरण प्रजातियां, जैसे कि OH., NO2., और ONOO-, DCFH को DCF में ऑक्सीकरण करती हैं। (iii) संक्रमण धातु, साइटोक्रोम c, और हीम पेरोक्सीडेज ऑक्सीजन और H2O2 की उपस्थिति में DCFH ऑक्सीकरण को बढ़ावा दे सकते हैं। (iv) सबसे महत्वपूर्ण बात, डीसीएफएच-डीए मध्यवर्ती उत्पाद डीसीएफएच-/ डीसीएफ का उत्पादन करता है, जो ऑक्सीजन की उपस्थिति में, अतिरिक्त सुपरऑक्साइड के उत्पादन को प्रेरित करता है। ओ2.- के साथ विघटन अतिरिक्त एच2ओ2 उत्पन्न करता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति तीव्रता और गलत तरीके से ऊंचा आरओएस स्तरों की कृत्रिम वृद्धि हो सकती है। कई लेखकों ने डीसीएफएच-डीए के उपयोग को इंट्रा-सेलुलर एच2ओ2 और अन्य आरओएस प्रजातियों 8,9,10,11,12,13,14का पता लगाने के लिए एक अविश्वसनीय फ्लोरोसेंट जांच के रूप में माना है।

डीसीएफएच-डीए के विपरीत, डीएचई विशेष रूप से सुपरऑक्साइड रेडिकल के साथ प्रतिक्रिया करता है, जिससे फ्लोरोसेंट उत्पाद, 2-हाइड्रॉक्सीथिडियम (2-ओएच ई +) की पीढ़ी होती है। गैर-सुपरऑक्साइड आरओएस प्रजातियां दूसरे फ्लोरोसेंट उत्पाद, एथिडियम (ई +) उत्पन्न करने के लिए डीएचई के साथ भी प्रतिक्रिया कर सकती हैं। जबकि 2-ओएच-ई + और ई + के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा अपेक्षाकृत समान हैं, ये दो अणु इंट्रासेल्युलर आरओएस प्रजातियों और डीएचई के बीच विशिष्ट बातचीत के अंत-उत्पादों का प्रतिनिधित्व करते हैं और ऑक्सीडेटिव तनाव के कारण कोशिकाओं के भीतर देखी गई कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए जिम्मेदार हैं। कुछ अध्ययनों ने संकेत दिया है कि कम यूवी रेंज तरंग दैर्ध्य (<400 एनएम) पर चयनात्मक उत्तेजना 2-ओएच एथिडियम उत्तेजना (ई + के विपरीत) के लिए अधिक विशिष्ट हो सकती है और इस प्रकार, सुपरऑक्साइड कट्टरपंथी उत्पादन 7,12,14। यह अकेले 386 एनएम एलईडी प्रकाश के साथ कोशिकाओं रोमांचक द्वारा मूल्यांकन किया गया था. 480 एनएम तरंग दैर्ध्य उत्तेजना के सापेक्ष, उत्सर्जन की एक कम तीव्रता 560 एनएम तरंग दैर्ध्य पर मनाया गया था (अनुपूरक चित्रा 1 और अनुपूरक चित्रा 2 देखें)। हालांकि, कोई निश्चित नहीं हो सकता है कि यह पूरी तरह से अकेले 2-ओएच एथिडियम प्रतिदीप्ति के कारण है और वर्तमान दृष्टिकोण की संभावित कमी का प्रतिनिधित्व करता है। अन्य अध्ययनों से पता चला है कि यूवी उत्तेजना (जैसे, 386 एनएम) के परिणामस्वरूप एक साथ एथिडियम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन भी हो सकता है, यद्यपि 2-ओएच एथिडियम 7,15 की तुलना में निचले स्तर पर। भले ही, हमारा प्रोटोकॉल डीएचई को उच्च-सामग्री इमेजिंग और स्क्रीनिंग सिस्टम का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन के बहुमत के मात्रात्मक अंतर को मापने के लिए एक बेहतर डाई विकल्प के रूप में स्थापित करता है।

आरओएस पीढ़ी के मध्यवर्ती ड्राइवरों की कमी (जैसे डीसीएफएच-डीए में देखी गई) को इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए डीएचई के उपयोग में एक बड़ा लाभ माना जाता है। हालांकि, डीएचई प्रतिदीप्ति का यह तंत्र अभी तक मजबूती से स्थापित नहीं हुआ है। ऐसे उदाहरणों में जहां आरओएस स्तरों की सटीक मात्रा का ठहराव आवश्यक है, किसी को मात्रात्मक सत्यापन के अतिरिक्त ऑर्थोगोनल तरीकों जैसे एचपीएलसी और/या तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) विधियों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है ताकि कोशिकाओं 8,9,13 के भीतर 2-ओएच-ई + के स्तर का सही अनुमान लगाया जा सके. हालांकि, किसी को पता होना चाहिए कि एचपीएलसी और एलसी-एमएस विधियों में मूल्यांकन के लिए कोशिकाओं का एकत्रीकरण और घुलनशीलता शामिल है। इस प्रकार, वर्तमान प्रोटोकॉल के रूप में एक प्रतिदीप्ति आधारित इमेजिंग विधि में एन्कोडेड स्थानिक-लौकिक जानकारी एचपीएलसी और एलसी-एमएस में खो जाएगी और इमेजिंग-आधारित आरओएस मूल्यांकन विधियों का एक बड़ा लाभ दर्शाती है। डीएचई के लाल-स्थानांतरित प्रतिदीप्ति का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि लाल बत्ती द्वारा की गई कम ऊर्जा के कारण लंबी तरंग दैर्ध्य प्रकाश (लाल रंग में) कोशिकाओं के लिए कम विषाक्त है।

सापेक्ष इंट्रासेल्युलर आरओएस परिवर्तनों को मापने के लिए डीएचई प्रतिदीप्ति की खुराक पर निर्भर प्रकृति का परीक्षण ऑक्सीडेटिव तनाव इंड्यूसर के रूप में मेनाडियोन और हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग करके किया गया था। मेनाडियोन और हाइड्रोजन पेरोक्साइड को आरओएस और ऑक्सीडेटिव तनाव पीढ़ी20,21के चर तंत्र के कारण परीक्षण पदार्थों के रूप में चुना गया था। जबकि मेनाडियोन एक्सपोजर के कारण आरओएस उत्पादन अप्रत्यक्ष (माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के माध्यम से) है, एच2ओ2 अधिक प्रत्यक्ष तरीके से ऑक्सीडेटिव तनाव पैदा करता है। मेनाडियोन की बढ़ती सांद्रता ने एक रैखिक, दोहराने योग्य और खुराक पर निर्भर तरीके से डीएचई प्रतिदीप्ति उत्पादन को बढ़ाया। मेनाडियोन के समान, एच2ओ2 आरओएस का एक प्रसिद्ध संकेतक है जो प्रत्यक्ष तरीके से फेंटन रसायन विज्ञान के माध्यम से हाइड्रॉक्सिल रेडिकल (ओएच) उत्पन्न करने में सक्षमहै 22. एच2ओ2 एक्सपोजर के कारण डीएचई प्रतिदीप्ति में एक रैखिक और खुराक पर निर्भर प्रतिक्रिया समान रूप से देखी गई थी। विशेष रूप से सुपरऑक्साइड रेडिकल के लिए डीएचई की चयनात्मकता के कारण, यह सीधे एच2ओ 2 के साथ प्रतिक्रिया नहीं करता है। इसके बजाय, इंट्रासेल्युलर सुपरऑक्साइड रेडिकल शुरू में एच2ओ2 के साथ प्रतिक्रिया करते हैं ताकि माध्यमिक आरओएस प्रजातियां बनाई जा सकें, जैसे कि हैबर-वीस और फेंटन प्रतिक्रियाओं के माध्यम से हाइड्रॉक्सी रेडिकल, जो तब डीएचई प्रतिदीप्ति23 द्वारा पता लगाया जाता है। इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन के बहुमत को मापने के द्वारा दो अलग-अलग ऑक्सीकरण पदार्थों के जवाब में डीएचई के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम वर्तमान प्रोटोकॉल 8,13में स्थापित किया गया है। ये परिणाम फ्लोरोसेंट डीएचई डाई की उपयोगिता को उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग दृष्टिकोणों का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए एक बेहतर विकल्प के रूप में स्थापित करते हैं।

डीएचई की बेहतर चयनात्मकता, संवेदनशीलता और ऑप्टिकल गुण इसे आरओएस उत्पादन और ऑक्सीडेटिव क्षति की उच्च-थ्रूपुट तरीके से जांच करने के लिए एक मूल्यवान विकल्प बनाते हैं, जैसा कि वर्तमान प्रोटोकॉल में स्थापित किया गया है। हमारी प्रयोगशाला में भविष्य के अध्ययन एक उच्च-थ्रूपुट सेटिंग में विभिन्न शारीरिक और रोग स्थितियों के तहत आरओएस और सेलुलर सिग्नलिंग तंत्र के बीच क्रॉस-रिएक्टिविटी में आरओएस मार्कर के रूप में डीएचई की भूमिका का पता लगाएंगे।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

RK और RRG को NIH NIGMS अनुदान P20 GM130422 के माध्यम से UNM सेंटर फॉर मेटल्स इन बायोलॉजी एंड मेडिसिन (CMBM) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। RRG को NM-INSPIRES P30 अनुदान 1P30ES032755 से एक पायलट पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। सीएक्स 7 सेलोमिक्स उपकरण के लिए इमेजिंग कोर समर्थन एनआईएच अनुदान P20GM121176 द्वारा वित्त पोषित एआईएम केंद्र कोर के माध्यम से प्रदान किया गया था। हम सीएक्स 7 सेलोमिक्स इमेजिंग प्लेटफॉर्म के उपयोग से संबंधित तकनीकी मुद्दों के साथ उनकी अमूल्य सहायता के लिए डॉ शरीना देसाई और डॉ ली चेन को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes  VWR  20170-038 
96- well plate  Corning Costar  07-200-90 
Cellomics Cx7 ThermoFisher  HCSDCX7LEDPRO
Collagen  Advanced Biomatrix   5056 
DHE (Dihydroethidium)  ThermoFisher  D1168 
DMEM  Sigma   6046 
FBS  VWR  97068-085 
GraphPad Prism GraphPad Version 6.0
HepG2 cell line ATCC
Hoechst  ThermoFisher  33342 
HUH7 cell line ATCC
Hydrogen Peroxide  Sigma  88597 
JHH4 cell line ATCC
Menadione  Sigma  M5625 

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 203 प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां डायहाइड्रोएथिडियम उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग हेपेटोबिलरी कैंसर मधुमेह विष विज्ञान प्रतिदीप्ति रंजक
डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) प्रतिदीप्ति डाई का उपयोग करके प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) पीढ़ी का उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग आकलन
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Kumar, R., Gullapalli, R. R. High… More

Kumar, R., Gullapalli, R. R. High Throughput Screening Assessment of Reactive Oxygen Species (ROS) Generation using Dihydroethidium (DHE) Fluorescence Dye. J. Vis. Exp. (203), e66238, doi:10.3791/66238 (2024).

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