Summary
Denne protokol beskriver en ny metode til kvantificering af intracellulære reaktive iltarter (ROS) ved hjælp af dihydroethidium (DHE) som en fluorescensfarvestofsonde ved hjælp af en screeningsmetode med høj kapacitet. Protokollen beskriver metoderne til kvantitativ vurdering af intracellulære reaktive iltarter (ROS) i de tre forskellige hepatocellulære carcinomcellelinjer.
Abstract
Reaktive iltarter (ROS) spiller en central rolle i reguleringen af cellulær metabolisme i fysiologiske og patologiske processer. Fysiologisk ROS-produktion spiller en central rolle i den rumlige og tidsmæssige modulering af normale cellulære funktioner såsom proliferation, signalering, apoptose og ældning. I modsætning hertil er kronisk ROS-overproduktion ansvarlig for et bredt spektrum af sygdomme, såsom kræft, hjerte-kar-sygdomme og diabetes, blandt andre. Kvantificering af ROS-niveauer på en nøjagtig og reproducerbar måde er således afgørende for at forstå normal cellulær funktionalitet. Fluorescensbilleddannelsesbaserede metoder til karakterisering af intracellulære ROS-arter er en almindelig tilgang. Mange af billeddannelsesprotokollerne i litteraturen bruger 2'-7'-dichlordihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) farvestof. Dette farvestof lider imidlertid af betydelige begrænsninger i dets anvendelse og fortolkningsevne. Den nuværende protokol demonstrerer brugen af en dihydroethidium (DHE) fluorescerende sonde som en alternativ metode til at kvantificere den samlede ROS-produktion i en høj gennemstrømningsindstilling. Den billeddannende platform med høj kapacitet, CX7 Cellomics, blev brugt til at måle og kvantificere ROS-produktionen. Denne undersøgelse blev udført i tre hepatocellulære kræftcellelinjer - HepG2, JHH4 og HUH-7. Denne protokol giver en dybtgående beskrivelse af de forskellige procedurer, der er involveret i vurderingen af ROS i cellerne, herunder - forberedelse af DHE-opløsning, inkubation af celler med DHE-opløsning og måling af DHE-intensitet, der er nødvendig for at karakterisere ROS-produktionen. Denne protokol viser, at DHE fluorescerende farvestof er et robust og reproducerbart valg til at karakterisere intracellulær ROS-produktion på en høj gennemstrømningsmåde. Metoder med høj kapacitet til måling af ROS-produktion vil sandsynligvis være nyttige i en række undersøgelser, såsom toksikologi, lægemiddelscreening og kræftbiologi.
Introduction
Reaktive iltarter (ROS) er en gruppe af naturligt forekommende, meget reaktive og tidsmæssigt ustabile kemiske radikaler dannet som en del af den normale cellulære metabolisme i celler. ROS spiller en central og væsentlig rolle i moduleringen af normale fysiologiske og biokemiske processer, der forekommer i cellerne 1,2. Den vigtigste kilde til ROS-produktion i celler er fra mitokondrieelektrontransportkæden (ETC) vej som en del af den normale bioenergetiske cyklus. Væsentlige yderligere kilder til ROS-produktion omfatter enzymatiske reaktioner såsom cellulære NADPH-oxidaser i celler. Metabolisme af fødevaremolekyler (fx glucose) sker via den oxidative phosphoryleringsvej i mitokondriematrixen. Et basisniveau for ROS-produktion er afgørende for at regulere normale fysiologiske cellesignalprocesser. Mange vigtige proteinmolekyler, der er en del af de glukosemetaboliske signalveje (fx Akt og PTEN), er kendt for at reagere på intracellulære ROS-niveauer. Derudover produceres ROS af forskellige intracellulære enzymer, såsom xanthinoxidase, nitrogenoxidsyntase og peroxisomale bestanddele som en del af de cellulære enzymatiske veje 1,2. I modsætning til de naturlige kilder til ROS fører visse miljøfaktorer, såsom xenobiotika, infektiøse stoffer, UV-lys, forurening, cigaretrygning og stråling, også til overdreven produktion af ROS, som er en vigtig drivkraft for intracellulær oxidativ stress 1,3. Forhøjet cellulær oxidativ stress kan forårsage skade på indfødte biomolekyler inde i en celle, såsom lipider, proteiner og DNA, hvilket forårsager forskellige sygdomme som kræft, diabetes, hjerte-kar-sygdomme, kronisk inflammation og neurodegenerative lidelser 1,3,4. Derfor er nøjagtige målinger af ROS afgørende for at forstå de cellulære mekanismer, der er involveret i oxidativ stressinduceret sygdomspatofysiologi.
På grund af de korte tidshorisonter for ROS-produktion og eliminering inde i celler er kvantitative målinger af forskellige ROS-radikaler fortsat en udfordring. Metoder som elektron paramagnetisk resonans (EPR)5, højtryksvæskekromatografi (HPLC) og fluorescenssondebaseret billeddannelse anvendes til at måle de forskellige cellulære ROS6. Mens metoder som EPR og HPLC giver kvantitativt nøjagtige estimater, involverer disse metoder ødelæggelse af den cellulære rumlige morfologi og er normalt i form af globale målinger og bulkmålinger af en prøve. I modsætning hertil bevarer billeddannelsesbaserede metoder såsom fluorescenssondebaserede metoder den cellulære morfologi og rumlige kontekst af ROS-generationen. Imidlertid er specificiteten af forskellige fluorescensprober for forskellige typer ROS-radikaler ikke veletableret 7,8. Flere fluorescerende sonder såsom dihydroethidium (DHE), dichlordihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA), dihydrorhodamin (DHR), dimethylanthracen (DMA), 2,7 dichlordihydroflurescein (DCFH), 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF) og MitoSox er tilgængelige til ROS-påvisning kommercielt. I de sidste årtier er DHE, MitoSox og DCFH-DA de almindeligt anvendte fluorescerende farvestoffer til måling af ROS i celler og væv 8,9. DCFH-DA er et meget anvendt farvestof til påvisning af intracellulærH2O2og oxidativ stress. På trods af populariteten af DCFH-DA har flere tidligere undersøgelser vist, at det ikke pålideligt kan bruges til at måle intracellulærH2O2og andre ROS-niveauer 8,9,10,11,12,13,14.
I modsætning hertil viser den fluorescerende sonde dihydroethidium (DHE) et specifikt svar på det intracellulære superoxidradikal (O2-). Mens superoxidradikalet er en af mange af de ROS-arter, der observeres i celler, er det et vigtigt radikal involveret i reduktionen af overgangsmetaller, omdannelse til peroxynitrat og dannelse af hydroperoxider, blandt andre intracellulære virkninger. DHE optages hurtigt af cellerne og har en fluorescensemission i det røde bølgelængdeområde15. Ved reaktion med superoxidradikal specifikt danner DHE et rødt fluorescerende produkt, 2-hydroxyethidium (2-OH-E +). Således, DHE kan betragtes som en specifik sonde for superoxid detektion. DHE kan dog også gennemgå uspecifik oxidation med ONOO- eller OH.,H2O2og cytokrom c for at danne et andet fluorescensprodukt, ethidium E +, som kan forstyrre de målte 2-OH-E + niveauer. Imidlertid repræsenterer disse 2-OH E + og E + produkter i kombination en stor del af de samlede cellulære ROS-arter, der observeres inde i en celle, når de farves med DHE. E + interkalerer i DNA, hvilket i høj grad forbedrer dets fluorescens 8,9,10,11,13,14,15,16. Da fluorescensspektrene for ethidium og 2-hydroxyethidium kun adskiller sig lidt, kan størstedelen af ROS-niveauer, der ses i en celle sekundært til superoxidproduktion, detekteres og måles ved hjælp af DHE-fluorescensprodukter. Disse ROS-arter identificeres ved hjælp af 480 nm bølgelængdeexcitation og 610 nm bølgelængdeemission 15,16,17.
Ud over at vælge en specifik fluorescerende ROS-detektionssonde er det vigtigt at vælge en følsom detektionsmetode til måling af intracellulær ROS. Nøjagtig vurdering af intracellulære ROS-niveauer er således nøglen til at identificere forstyrrede redoxbalancetilstande, der forekommer i syge celler eller celler, der har været udsat for forskellige miljømæssige stressfaktorer såsom stråling, toksikologiske forbindelser og genotoksiske stoffer18. Da ROS er et almindeligt forekommende fænomen i celler, der er ansvarlig for at regulere en række cellesignalaktiviteter, er robuste metoder til påvisning af ROS afgørende. For at muliggøre en sådan evaluering med høj kapacitet af ROS-produktion i celler bruger denne protokol en HCS-platform (high-content screening) til at måle ROS-arterne. Den nuværende protokol tillader analyse med høj kapacitet af intracellulær ROS-produktion, hvilket er af afgørende betydning i mange toksikologiundersøgelser19. Denne protokol har til formål at give en nem og alsidig løsning til at detektere og måle intracellulær ROS i klæbende hepatocellulære carcinomceller. De kemiske reagenser afH2O2og menadion anvendes som potente ROS-stimulatorer til at måle de relative niveauer af ROS-produktion i en kontrolleret og høj gennemstrømningsindstilling. Denne protokol kan finjusteres til at måle ROS-produktionen i vedhængende og ikke-fasthængende celler under passende betingelser, hvis det er nødvendigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Testcellerne (HepG2, HUH7 og JHH4 hepatocellulære carcinomceller) frøes i en 96-brøndplade med en såtæthed på 10.000 celler/brønd i et endeligt såvolumen på 200 μL pr. brønd.
- Før dyrkning af HepG2-cellerne skal du belægge de 96 pladebrønde med type IV-kollagen (50 μg/ml) i 2 timers varighed ved stuetemperatur (RT). For at undgå størkning af stamkollagen anbringes stamopløsningen i is og derefter fortyndingsprocessen påbegyndes til den ønskede koncentration.
- Efter en 2 timers inkubationsperiode aspireres det overskydende kollagen og vaskes brøndene tre gange med 1x PBS.
- Dyrk cellerne i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) natten over ved 37 °C og 5% CO2 koncentration i en befugtet inkubator.
- Næste dag, eller når du når 80% -90% sammenløbet, alt efter hvad der kommer først, skal du behandle cellerne med henholdsvisH2O2(ubehandlet, 250 μM, 500 μM, 750 μM og 1000 μM) og Menadion (ubehandlet, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) i 30 minutter for at fremkalde den repræsentative oxidative stress.
- Alternativt kan du vælge at teste cellerne med det ønskede teststof efter eget valg, der er i stand til at fremkalde oxidativt stress i cellerne.
2. Lager og fortyndet opløsningsforberedelse til DHE-farvning af celler
- Forbered DHE stamopløsning (5 mg / ml eller 15,9 mM) ved at opløse 5 mg DHE i 1 ml DMSO.
- DHE-stamopløsningen fortyndes med dobbeltdestilleret autoklaveret vand til en endelig koncentration på 100 μM.
- For at undgå fryse- og optøningsprocessen af farvestoffet (som kan beskadige fluorescensegenskaberne over tid) fremstilles flere delprøver i 1,5 ml centrifugeglas med en koncentration på 100 μM og opbevares ved -20 °C.
- For at opnå en endelig arbejdskoncentration på 10 μM skal du bruge en alikvot af 100 μM DHE-koncentrationen og fortynde den med forvarmede DMEM-medier.
BEMÆRK: Arbejdsløsningen skal tilberedes frisk på forsøgsdagen. - Vortex den arbejdende fluorescensfarveopløsning i 5-10 s for at sikre korrekt blanding af farvestoffet.
3. DHE-farvningsproces
- Fjern det lægemiddel- eller teststofholdige medie fra hvert hul og vask det forsigtigt en gang med enten 1x PBS eller DMEM.
BEMÆRK: Når du udfører tilsætnings- eller vasketrinnene i eksperimentet, er det afgørende at undgå direkte kontakt mellem cellerne og pipettoren. Dette kan opnås ved forsigtigt at pipettere PBS langs siderne af brøndene for at minimere enhver potentiel mekanisk skade på cellerne. Sikring af, at pipettor ikke direkte berører cellerne, hjælper med at opretholde celleintegriteten og levedygtigheden i eksperimentets varighed. - Der tilsættes 100 μL DMEM-medier indeholdende 10 μM DHE (arbejdsløsning) i hvert hul og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.
- Efter 30 min inkubationstid fjernes de DHE-holdige medier og vaskes hver brønd forsigtigt tre gange med 1x fosfatbufret saltvand (PBS). Dette kan udføres med en flerkanals pipetter for at sikre hurtig vending.
- Der tilsættes 200 μL 1x PBS til hvert hul med Hoechst 33342 kernefarvningsfarvestof i 10 minutter ved RT.
- Hoechst 33342 kernefarvningsopløsningen fjernes fra brønden, og der tilsættes 200 μL 1x PBS til hvert hul.
BEMÆRK: For at opnå faste celler skal du følge den samme protokol som for de levende celler, med et ekstra trin med tilsætning af 4% PFA i 5 minutter efter behandling og DHE-farvning. PFA-opløsningen fjernes og cellerne vaskes med 1x PBS. Inkuber derefter cellerne med det nukleare farvningsfarve i 10 minutter. - Flyt pladen over til screeningsplatformen med højt indhold, fluorescensmikroskopi eller pladelæser til billedoptagelse så hurtigt som muligt.
4. Billedoptagelse og intensitetsmåling
- Indlæsning af plader
- Åbn Cellomics CX7 HCS-softwaren (high-content screening) til dataindsamling.
- Kalibrer omhyggeligt billedplatformen i henhold til producentens specifikationer på forhånd med den specifikke 96-brønds plade, der vælges til brug for at undgå uklare eller slørede billeder i dataene.
BEMÆRK: Multibrøndsplader fra forskellige leverandører kan have forskellige materialeegenskaber og kan påvirke kvaliteten af de endelige opnåede billeder. - Når de er kalibreret, skal du gemme de systemparametre, der er specifikke for plademærket, i instrumentdatabasen og genbruge dem til fremtidige dataindsamlinger.
- Pladen med de forberedte prøver anbringes forsigtigt på det opvarmede trin i HCS-billeddannelsessystemet. Sørg for, at pladen er sikkert placeret og i den korrekte retning til billeddannelse på mikropladeholderen (dvs. find etiketten mærket A1 på læserstadiet, og drej derefter mikropladen, så placeringen af brønd A1 matcher hjørnet med klistermærket).
- Tryk forsigtigt ned på mikropladen for at sikre, at den hviler fladt mod scenen. Ujævn udjævning af pladen i HCS-systemet kan føre til fejl i billedoptagelse.
- Når pladen er på plads, skal du trykke på og holde Ctrl-tasten nede og derefter klikke på Ctrl-OK i dialogboksen Plate Load/Unload i softwaren.
- Valg af billedparametre
- I HCS-billeddannelsessystemet skal du åbne målaktiveringstilstand i Cellomics-bioapplikationsgrænsefladen og oprette en ny protokol ved hjælp af tokanals opsætningsprotokol, der er kompatibel med (a) nuklear farvning og (b) DHE-fluorescenssondedataindsamling. I den nuværende protokol blev filtrene 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS og 386_BGS_RS anvendt til henholdsvis a) Hoechst 33342-farvning af kernekraft, b) samlet ROS-produktion og c) detektion af superoxidradikaler. Valget af disse filtre blev drevet af den specifikke overlapning for emissionsegenskaberne for hvert farvestof (DAPI og DHE), der blev brugt som en del af denne protokol.
BEMÆRK: Navngivningskonventionen for filtre, f.eks. 386-23_BGRFRN_BGRFRN, henviser til excitationen af prøven med 386 nm lys med en båndbredde på 23 nm efterfulgt af et dikroisk filter, der passerer blåt (B), grønt (G), rødt (R), langt rødt (FR) og nær infrarødt (N) lys ved bestemte bølgelængdeområder, og 386_BGS_RS henviser til et emissionsfilter, der passerer BGS- og RS-emissionsbølgelængdelys efter dikroikken. - Angiv målene for billedoptagelsesprocessen i softwareprotokolgrænsefladen, f.eks. 10x eller 20x forstørrelse, efter behov.
- Vælg den passende objektiv forstørrelse afhængigt af det ønskede niveau af billeddannelsesdetaljer og opløsninger, der er nødvendige for eksperimentet. Opløsningen af hvert mål er dog fast. Detaljer med højere opløsning vil gøre det nødvendigt at ændre målet på platformen. I den nuværende protokol anvendes et 20x, 0,45 NA-mål, som er en del af screeningsplatformen med højt indhold, der bruges i denne protokol.
BEMÆRK: 20x-målet repræsenterer en god afvejning mellem detaljer i billedopløsningsopløsningen og den hastighed for erhvervelse, der er nødvendig for at registrere ROS-ændringer over tid. Der kan vælges højere forstørrelsesmål (f.eks. 40X), men dette vil føre til øgede anskaffelsestider. - Angiv eksponeringsindstillingerne for billedoptagelseskameraet, f.eks. eksponeringstid, binning af kameraet og z-stack-intervallet, i henhold til protokollens specifikke krav.
BEMÆRK: Eksponeringstiden (ofte i millisekunder) varierer afhængigt af signalstyrken og følsomheden af de specifikke anvendte fluoroforer. Dette kan også variere lidt fra eksperiment til eksperiment baseret på farvestofkoncentrationen og farvningskvaliteten. I den nuværende protokol er parametrene for erhvervelse fastsat som følger - Mål% - 35%, billedoptagelsestilstand - 1104 x 1104 (med 2x2 binning) og mål 20x, 0, 45 NA. Disse parametre kan fastsættes i overensstemmelse med de specifikke forsøgsbetingelser.
- I HCS-billeddannelsessystemet skal du åbne målaktiveringstilstand i Cellomics-bioapplikationsgrænsefladen og oprette en ny protokol ved hjælp af tokanals opsætningsprotokol, der er kompatibel med (a) nuklear farvning og (b) DHE-fluorescenssondedataindsamling. I den nuværende protokol blev filtrene 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS og 386_BGS_RS anvendt til henholdsvis a) Hoechst 33342-farvning af kernekraft, b) samlet ROS-produktion og c) detektion af superoxidradikaler. Valget af disse filtre blev drevet af den specifikke overlapning for emissionsegenskaberne for hvert farvestof (DAPI og DHE), der blev brugt som en del af denne protokol.
- Parametre for billedkonfiguration
BEMÆRK: Når billedparametrene er indstillet, kan billedindsamlingsprocessen startes ved hjælp af softwaregrænsefladen.- Parametre for indsamling af billeder
- Identificer det primære sporingsobjekt af interesse (kernen i cellerne) ved hjælp af forskellige algoritmer, der er tilgængelige i instrumentet (optik - isodata, fast og trekant).
BEMÆRK: Isodatametoden til identifikation og mærkning af det primære objekt anvendes i denne protokol. - Segmenter objektet (hvis nogen) enten efter form eller intensitetsparameter.
- Valider det primære objekt baseret på de ønskede størrelses-, form- og intensitetsparametre, der er unikke for hver celletype.
- Definer derefter 'interesseområdet' (ROI) omkring dette primære objekt.
BEMÆRK: ROI er en nøgleparameter for dataindsamling, der definerer det sted, hvor intensiteten af fluorescensfarvestoffet identificeres som konsistent og gentageligt på tværs af celletyper. ROI definerer nøgleparametrene (såsom farvestoffets intensitet), som måles for hvert primært sporingsobjekt (dvs. en celle) i forskellige kanaler i instrumentet. ROI kan defineres i form af en cirkel eller ring omkring kernen i hver celle. HCS-softwaren opnår automatisk intensiteten af DHE-fluorescensfarvestofmarkøren i kanal 2 inden for grænsen for ROI for hver celle, der segmenteres og analyseres på en automatiseret måde. - Indstil en cirkel på 20 μm omkring det primære objekt (kernen). Afstanden på 20 μm blev valgt i denne undersøgelse baseret på de omtrentlige størrelser af de forskellige cellelinjer, der anvendes i denne protokol (HepG2, JHH-4 og HUH-7). 20 μm ring ROI omkring cellerne opnåede fluorescensintensiteten på en konsistent og gentagelig måde.
BEMÆRK Nøgleparameteren ved valg af ROI er evnen til tilstrækkeligt at dække celleområdet; størrelsen af det cirkulære investeringsafkast afhænger af cellestørrelsen. Større celler kan kræve et større investeringsafkast og omvendt for et mindre investeringsafkast. Disse parametre skal bestemmes på forhånd for hver celletype og fluorescensfarvestof af interesse.
- Identificer det primære sporingsobjekt af interesse (kernen i cellerne) ved hjælp af forskellige algoritmer, der er tilgængelige i instrumentet (optik - isodata, fast og trekant).
- Parametre for indsamling af billeder
- Populationskarakterisering og udvalgte funktioner, der skal gemmes
- Når de forskellige anskaffelsesparametre er defineret i HCS-billeddannelsesprotokollen, skal du indstille HCS-systemet til dataindsamlingstilstand.
- Parametrene for billedhentning for denne protokol blev indstillet som følger: en scanningsgrænse på 1000 celler/brønd med et minimumskrav på 10 objekter (celler) pr. felt.
BEMÆRK: Antallet af felter, der blev vurderet for hver brønd, blev bestemt ud fra det endelige celletal, der nåede tallet 1000. HCS-systemet fortsætter med at søge forskellige steder i brønden, indtil det får målpopulationen på 1000 celler / brønd. Erhvervelseshastigheden afhænger således af sammenløbet og det samlede celleantal, der er til stede i hver brønd på 96-brøndpladen. I den nuværende protokol blev den samlede og gennemsnitlige intensitet af kanal 2 (der repræsenterer superoxidradikalerne og den samlede ROS-produktion) indsamlet fra hver brønd til yderligere nedstrømsanalyser.
- Billedoptagelse, -behandling og -analyse
- Når du har justeret og afsluttet billedoptagelsesparametrene, skal du starte scanningsprocessen for hver 96-brøndplade.
BEMÆRK: Cellomics CX7-billeddannelsessystem muliggør screening med højt indhold og automatiseret analyse af prøver af en række parametre, herunder ROS-produktion i celler på en høj gennemstrømningsmåde. Ud over ROS-produktionen er HCS-systemet i stand til at give yderligere værdifuld information om forskellige parametre såsom cellemorfologi, subcellulær lokalisering og mange andre cellulære egenskaber af interesse. Når HCS-billeddannelsesplatformen er optimeret til erhvervelse, giver den mulighed for omfattende, kvalitativ og kvantitativ karakterisering af celleparametre på en robust måde. - Når scanningen er fuldført, skal du starte View Analysis-softwaren og eksportere de forskellige kvantitative dataparametre i et .csv format til yderligere analyse.
- Brug tredjepartssoftware til at kopiere og indsætte de forskellige kvantitative værdier af interesse for yderligere downstream-analyser.
BEMÆRK: I den nuværende protokol, GraphPad Prism software blev brugt til at analysere DHE intensitet værdier som reaktion på induceret oxidativ stress på grund af H2O2 og menadion eksponeringer.
- Når du har justeret og afsluttet billedoptagelsesparametrene, skal du starte scanningsprocessen for hver 96-brøndplade.
- Data og statistisk analyse
- Beregn den gennemsnitlige gennemsnitlige intensitet af kanal 2 (repræsenterer de samlede ROS-værdier og superoxidradikaler).
BEMÆRK: Alle eksperimenterne til beregning af intensitetsværdierne blev gentaget tre gange med 6 replikater pr. tilstand på hvert doseringsniveau. - Udfør envejs ANOVA eller t-test for at måle forskellene i intensitetsværdierne mellem forskellige testbetingelser.
- Beregn den gennemsnitlige gennemsnitlige intensitet af kanal 2 (repræsenterer de samlede ROS-værdier og superoxidradikaler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dihydroethidium (DHE) er et superoxidresponsivt fluorescensfarvestof, der giver specifik information om de intracellulære ROS-tilstande. DHE-farvestof udsender iboende blå fluorescens i cytoplasmaet. Ved interaktion med superoxidradikaler omdannes det imidlertid til 2-hydroxyethidium, som udsender fluorescens i de røde bølgelængder (>550 nm) (figur 1). DHE-farvestof transporteres let ind i cellerne og kernen. Den udsendte fluorescens kan visualiseres med en fluorescensmikroskopiopsætning, der almindeligvis er tilgængelig i mange laboratorier. I den aktuelle undersøgelse blev nytten af DHE-farvestof på flere hepatocellulære carcinomcellelinjer - HUH7-, JHH4- og HepG2-celler som en sonde af ROS-artsgenerering testet på en screeningsplatform med højt indhold. Cellerne blev behandlet med to ROS-genererende midler - (a) hydrogenperoxid og (b) menadion i 30 minutter på en dosisafhængig måde (se figur 2 og figur 3 for doseringsdetaljer) for at fremkalde oxidativ stress i cellerne efterfulgt af DHE-farvestofmærkning i en 96-brøndplade. BådeH2O2og menadion øgede fluorescensintensiteten dramatisk i alle tre cellelinjer på en dosisafhængig måde. Ved hjælp af billedsegmenterings- og kvantificeringsalgoritmerne inden for screeningsplatformen med høj kapacitet blev intensiteten af ROS-induceret DHE-fluorescens kvantificeret i 1000 celler pr. Brønd på tværs af seks replikater. Tre uafhængige replikater blev målt, og resultaterne blev aggregeret og analyseret. Hoechst 33342-kernepletten spiller en vigtig rolle i identifikationen af det plan, hvori de klæbende celler er til stede i hver brønd. Derudover kan 2-OH-E + og E + fluorescensen detekteres i henholdsvis kernen og cytoplasmaet i de testede celler på screeningsplatformen med høj kapacitet (se figur 4).
Eksponering forH2O2resulterede i en statistisk signifikant forøgelse af den ROS-inducerede fluorescens på tværs af alle cellelinjerne analyseret på en dosisafhængig måde (se figur 2; nederste panel). Et sådant dosisafhængigt respons sås imidlertid ikke ved menadioneksponering. Med menadion viste JHH4-cellelinjen en dosisafhængig stigning i fluorescerende intensitet, mens der i HepG2- og HUH7-cellelinjer kun blev observeret en signifikant forskel i fluorescensintensitet ved de højere menadionkoncentrationer (se figur 3; nederste panel). Disse forskelle i ROS-genereringsresponser kan skyldes de forskellige mekanismer for ROS-produktion afH2O2og menadion. MensH2O2udløser ROS-dannelse i celler på en mere direkte måde (fx gennem virkningen af antioxidantenzymer, såsom peroxidaser og katalaser), antages menadion at generere ROS-arter på en indirekte måde gennem induceret mitokondriel dysfunktion. På grund af den indirekte mekanisme for ROS-produktion kan DHE-fluorescens kræve mere tid til at manifestere sig med menadion. Disse resultater tyder på, at ROS-afhængig DHE-fluorescens er følsom over for varigheden af oxidative stresseksponeringer, koncentration og celletyper. Optimering af den eksperimentelle protokol for hver unik celletype er således et must. Endnu vigtigere demonstrerer denne protokol gennemførligheden af brugen af DHE-farvestof som et ROS-detektionsmiddel på en høj gennemstrømningsmåde, som er til brug inden for områder som toksikologi, kræftbiologi og lægemiddelscreening.
Figur 1: Et skema, der illustrerer vejene for oxidativ omdannelse af DHE-fluorescensmolekyle til henholdsvis 2-hydroxyethidium (2-OH-E +) og ethidium (E +). Fluorescensemissionsspektrene for 2-OH-E+ og E+ overlapper hinanden ved en excitation på 480 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Hydrogenperoxidbehandling øger intracellulære ROS-niveauer på en dosisafhængig måde. Hepatocellulære carcinomceller - (A) HUH7, (B) JHH4 og (C) HepG2 blev behandlet medH2O2i doser på 250 μM, 500 μM, 750 μM og 1000 μM i en periode på 30 minutter. Cellerne blev farvet med DHE-farvestof (10 μM) i dyrkningsmedier i yderligere 30 minutter efterfulgt af Hoechst 33342 nuklear farvning. I alt 1000 celler blev talt i hver brønd. En lineær, dosisafhængig stigning i DHE-fluorescensen observeres på tværs af alle tre cellelinjer (øverste panel). Statistisk signifikante stigninger i fluorescens ses i alle cellelinjer til dosering af 500 μM og derover (nederste panel). Hvert datasæt er i gennemsnit seks replikater i en 96-brønds plade opnået fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3). Behandlingsbetingelserne blev sammenlignet med ubehandlede prøver ved hjælp af en envejs ANOVA test (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; billedskalabjælke - 50 μm) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Menadionbehandling øger intracellulære ROS-niveauer på en dosisafhængig måde. Hepatocellulære carcinomceller - (A) HUH7, (B) JHH4 og (C) HepG2 blev behandlet med menadion i doser på 25 μM, 50 μM, 75 μM og 100 μM i en periode på 30 minutter. Cellerne blev farvet med DHE-farvestof (10 μM) i dyrkningsmedier i yderligere 30 minutter efterfulgt af Hoechst 33342 nuklear farvning. I alt 1000 celler blev talt i hver brønd. En lineær, dosisafhængig stigning i DHE-fluorescensen observeres på tværs af alle tre cellelinjer (øverste panel). Statistisk signifikante stigninger i fluorescens ses konsekvent for den maksimale dosis (100 μM; bundpanel). Der observeres variabilitet for de resterende doser menadion på tværs af forskellige cellelinjer (JHH4 > HUH7 > HepG2). Hvert datasæt er i gennemsnit seks replikater i en 96-brønds plade opnået fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3). Behandlingsbetingelserne blev sammenlignet med ubehandlede prøver ved hjælp af en envejs ANOVA test (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; billedskalabjælke - 50 μm) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Enkeltcelle DHE-fluorescens - Et nærbillede af DHE-fluorescensændringer observeret efter behandling med (A) hydrogenperoxid og (B) menadion i en varighed på 30 minutter. Cytoplasmatiske og nukleare ændringer af DHE-fluorescens observeres i de forskellige celler. Den automatiske segmenteringsmaske, der genereres af screeningsplatformen med højt indhold, ses også. Billedskalabjælke - 10 μm. Forstørrelse - 20x. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Billeddannelse af superoxiddrevet DHE-fluorescens som reaktion på hydrogenperoxid. Hepatocellulære carcinomceller - (A) HUH7, (B) JHH4 og (C) HepG2 blev behandlet medH2O2i doser på 250 μM, 500 μM, 750 μM og 1000 μM i en periode på 30 minutter. Cellerne blev derefter farvet med DHE (10 μM) farvestof i kulturmedier i yderligere 30 minutter. Derefter blev celler belyst med 386 nm LED, og fluorescensbilleddannelse indsamlet ved >560 nm. Der blev ikke udført nuklear modfarvning for at undgå spektral krydstale. En dosisafhængig stigning i DHE-fluorescens observeres ved doser > 500 μM. UV-belyst DHE-fluorescens forventes at skyldes størstedelen af superoxidradikalproduktionen. Hvert datasæt er i gennemsnit seks replikater i en 96-brøndplade opnået fra to uafhængige eksperimenter (n = 2). Behandlingsbetingelserne blev sammenlignet med ubehandlede prøver ved hjælp af en envejs ANOVA (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; billedskalabjælke - 50 μm) Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Billeddannelse af superoxiddrevet DHE-fluorescens som reaktion på menadion - Hepatocellulære carcinomceller - (A) HUH7, (B) JHH4 og (C) HepG2 blev behandlet med menadion i doser på 25 μM, 50 μM, 75 μM og 100 μM i en periode på 30 minutter. Cellerne blev derefter farvet med DHE (10 μM) farvestof i kulturmedier i yderligere 30 minutter. I lighed med hydrogenperoxid blev der observeret en dosisafhængig stigning i DHE-fluorescens. Hvert datasæt er i gennemsnit seks replikater i en 96-brøndplade opnået fra to uafhængige eksperimenter (n = 2). Behandlingsbetingelserne blev sammenlignet med ubehandlede prøver ved hjælp af en envejs ANOVA (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; billedskalabjælke - 50 μm) Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse blev der etableret en protokol til vurdering af superoxiddrevet intracellulær reaktive iltarter (ROS) produktion ved hjælp af dihydroethidium (DHE) fluorescensfarvestof på et screeningssystem med højt indhold. Et flertal af de nuværende protokoller, der er tilgængelige i litteraturen, bruger DCFH-DA som en fluorescensbilleddannelsessonde til at kvantificere ROS-arter. Flere undersøgelser har imidlertid vist, at DCFH-DA ikke er en ideel sonde til måling af intracellulær ROS. Forskellige grunde, der postuleres for DCFH-DAs uegnethed som sonde, inkluderer - (i) DCFH-DA udviser ikke en direkte reaktion medH2O2, hvilket gør det til et uhensigtsmæssigt farvestof til evaluering af det intracellulæreH2O2-niveau. (ii) Flere en-elektronoxiderende arter, såsom OH., NO2. og ONOO-, oxiderer DCFH til DCF. (iii) overgangsmetaller, cytokrom c og hæmperoxidase kan fremme DCFH-oxidation i nærvær af ilt ogH2O2. (iv) Vigtigst er det, at DCFH-DA producerer mellemproduktet DCFH.- / DCF., som i nærvær af ilt inducerer produktionen af yderligere superoxid. Dismutation medO2.- genererer yderligereH2O2, hvilket kan resultere i en kunstig forøgelse af fluorescensintensiteten og fejlagtigt forhøjede ROS-niveauer. Flere forfattere har vurderet brugen af DCFH-DA som en upålidelig fluorescerende sonde til påvisning af intracellulærH2O2og andre ROS-arter 8,9,10,11,12,13,14.
I modsætning til DCFH-DA reagerer DHE specifikt med superoxidradikalet, hvilket fører til dannelsen af et fluorescerende produkt, 2-hydroxyethidium (2-OH E+). Ikke-superoxid ROS arter kan også reagere med DHE for at generere et andet fluorescerende produkt, ethidium (E +). Mens fluorescensspektrene for 2-OH-E + og E + er relativt ens, repræsenterer disse to molekyler slutprodukterne af de specifikke interaktioner mellem de intracellulære ROS-arter og DHE og er ansvarlige for den samlede fluorescensintensitet observeret i cellerne på grund af oxidativ stress. Nogle undersøgelser har indikeret, at selektiv excitation ved bølgelængder med kortere UV-område (<400 nm) kan være mere specifik for 2-OH ethidiumexcitation (i modsætning til E +) og dermed superoxidradikalproduktion 7,12,14. Dette blev vurderet ved at spænde cellerne med 386 nm LED-lys alene. I forhold til 480 nm bølgelængdeexcitationen blev der observeret en reduceret emissionsintensitet ved 560 nm bølgelængde (se supplerende figur 1 og supplerende figur 2). Man kan imidlertid ikke være sikker på, at dette udelukkende skyldes 2-OH ethidiumfluorescens alene og repræsenterer en potentiel mangel ved den nuværende tilgang. Andre undersøgelser har vist, at UV-excitation (f.eks. 386 nm) også kan resultere i samtidig emission af ethidiumfluorescens, omend i lavere niveauer sammenlignet med 2-OH ethidium 7,15. Uanset hvad etablerer vores protokol DHE som et bedre farvestofalternativ til at måle de kvantitative forskelle i størstedelen af intracellulær ROS-produktion ved hjælp af et billeddannelses- og screeningssystem med højt indhold.
Manglen på mellemliggende drivere for ROS-generering (som dem, der ses i DCFH-DA) postuleres at være en stor fordel i brugen af DHE til at evaluere intracellulær ROS-produktion. Men, denne mekanisme af DHE fluorescens er ikke fast etableret endnu. I tilfælde, hvor nøjagtig kvantificering af ROS-niveauerne er nødvendig, rådes man til at anvende yderligere ortogonale metoder til kvantitativ validering, såsom HPLC- og/eller væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) metoder til nøjagtigt at estimere niveauerne af 2-OH-E+ i cellerne 8,9,13. Man skal dog være opmærksom på, at HPLC- og LC-MS-metoder nødvendigvis involverer aggregering og opløselighed af cellerne til evaluering. Således ville den rumlige-tidsmæssige information, der er kodet i en fluorescensbaseret billeddannelsesmetode som i den nuværende protokol, gå tabt i HPLC og LC-MS og repræsenterer en stor fordel ved billeddannelsesbaserede ROS-vurderingsmetoder. En yderligere fordel ved den rødforskudte fluorescens af DHE er den længere bølgelængde lys (i rødt) er mindre giftigt for celler på grund af den lavere energi, der bæres af rødt lys.
Den dosisafhængige karakter af DHE-fluorescens til måling af de relative intracellulære ROS-ændringer blev testet ved anvendelse af menadion og hydrogenperoxid som oxidative stressinducere. Menadion og hydrogenperoxid blev valgt som teststoffer på grund af de variable mekanismer for ROS og oxidativ stressgenerering 20,21. Mens ROS-produktion på grund af menadioneksponering er indirekte (gennem mitokondriel dysfunktion), producererH2O2oxidativ stress på en mere direkte måde. Stigende koncentrationer af menadion førte til forbedret DHE fluorescens produktion i en lineær, gentagelig, og dosisafhængig måde. I lighed med menadion erH2O2en velkendt inducer af ROS, der er i stand til at generere hydroxylradikaler (OH.) gennem Fenton-kemi på en direkte måde22. En lineær og dosisafhængig respons blev ligeledes observeret i DHE fluorescens på grund af H2O2 eksponering. På grund af selektiviteten af DHE for superoxidradikalet specifikt, reagerer det ikke direkte medH2O2. I stedet reagerer de intracellulære superoxidradikaler, der produceres, oprindeligt medH2O2for at danne sekundære ROS-arter, såsom hydroxyradikaler via Haber-Weiss- og Fenton-reaktionerne, som derefter detekteres af DHE-fluorescens23. Fluorescensemissionsspektret af DHE som reaktion på to forskellige oxiderende stoffer ved at måle størstedelen af intracellulær ROS-produktion er etableret i den nuværende protokol 8,13. Disse resultater etablerer nytten af fluorescerende DHE-farvestof som et bedre alternativ til påvisning og kvantificering af intracellulære ROS-niveauer ved hjælp af screeningsmetoder med høj kapacitet.
Den overlegne selektivitet, følsomhed, og optiske egenskaber DHE gør det til et værdifuldt alternativ til at undersøge ROS produktion og oxidative skader i en high-throughput måde, som fastlagt i den nuværende protokol. Fremtidige undersøgelser i vores laboratorium vil undersøge DHE's rolle som en ROS-markør i krydsreaktiviteten mellem ROS og cellulære signalmekanismer under forskellige fysiologiske og patologiske tilstande i en høj gennemstrømningsindstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
RK og RRG blev støttet af et tilskud fra UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) gennem NIH NIGMS bevilling P20 GM130422. RRG blev støttet af en pilotpris fra NM-INSPIRES P30 bevillingen 1P30ES032755. Den billeddannende kernestøtte til CX7 Cellomics-instrumentet blev leveret gennem AIM-centerkernerne finansieret af NIH-tilskud P20GM121176. Vi vil gerne takke Dr. Sharina Desai og Dr. Li Chen for deres uvurderlige hjælp med tekniske problemer i forbindelse med brugen af CX7 Cellomics billedbehandlingsplatform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press, Oxford Academic. USA. (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham,, et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
