Summary
이 프로토콜은 고처리량 스크리닝 접근 방식을 사용하여 형광 염료 프로브로 디하이드로에티듐(DHE)을 사용하여 세포 내 활성 산소종(ROS)을 정량화하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 세 가지 서로 다른 간세포 암종 세포주에서 세포 내 활성 산소종(ROS)의 정량적 평가 방법을 설명합니다.
Abstract
활성산소종(ROS)은 생리학적 및 병리학적 과정에서 세포 대사를 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 생리적 ROS 생산은 증식, 신호 전달, 세포 사멸 및 노화와 같은 정상적인 세포 기능의 공간적, 시간적 조절에 중심적인 역할을 합니다. 대조적으로, 만성 ROS 과잉 생산은 암, 심혈관 질환 및 당뇨병과 같은 광범위한 질병의 원인이 됩니다. 따라서 ROS 수준을 정확하고 재현 가능한 방식으로 정량화하는 것은 정상적인 세포 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 세포 내 ROS 종을 특성화하기 위한 형광 이미징 기반 방법은 일반적인 접근 방식입니다. 문헌에 있는 많은 이미징 ROS 프로토콜은 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA) 염료를 사용합니다. 그러나 이 염료는 사용법과 해석 가능성에 상당한 제한이 있습니다. 현재 프로토콜은 고처리량 설정에서 총 ROS 생산량을 정량화하기 위한 대체 방법으로 디하이드로에티듐(DHE) 형광 프로브를 사용하는 방법을 보여줍니다. 고처리량 이미징 플랫폼인 CX7 Cellomics를 사용하여 ROS 생산량을 측정하고 정량화했습니다. 이 연구는 HepG2, JHH4 및 HUH-7의 세 가지 간세포암 세포주에서 수행되었습니다. 이 프로토콜은 DHE 용액 준비, DHE 용액을 사용한 세포 배양 및 ROS 생산을 특성화하는 데 필요한 DHE 강도 측정을 포함하여 세포 내 ROS 평가와 관련된 다양한 절차에 대한 심층적인 설명을 제공합니다. 이 프로토콜은 DHE 형광 염료가 고처리량 방식으로 세포 내 ROS 생산을 특성화하기 위한 강력하고 재현 가능한 선택임을 보여줍니다. ROS 생산을 측정하기 위한 고처리량 접근법은 독성학, 약물 스크리닝 및 암 생물학과 같은 다양한 연구에 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
활성산소종(ROS)은 세포의 정상적인 세포 대사의 일부로 형성되는 자연적으로 발생하고 반응성이 높으며 일시적으로 불안정한 화학 라디칼 그룹입니다. ROS는 세포 1,2에서 발생하는 정상적인 생리학적 및 생화학적 과정의 조절에 핵심적이고 필수적인 역할을 합니다. 세포에서 ROS 생산의 주요 원천은 정상적인 생체 에너지 주기의 일부인 미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC) 경로에서 비롯됩니다. ROS 생산의 중요한 추가 소스에는 세포 내 세포 NADPH 산화효소와 같은 효소 반응이 포함됩니다. 식품 분자(예: 포도당)의 대사는 미토콘드리아 기질의 산화적 인산화 경로를 통해 발생합니다. ROS 생산의 기본 수준은 정상적인 생리적 세포 신호 전달 과정을 조절하는 데 필수적입니다. 포도당 대사 신호 전달 경로(예: Akt 및 PTEN)의 일부인 많은 주요 단백질 분자는 세포 내 ROS 수준에 반응하는 것으로 알려져 있습니다. 또한 ROS는 세포 효소 경로의 일부로서 크산틴 산화효소, 산화질소 합성효소 및 과산화솜 성분과 같은 다양한 세포 내 효소에 의해 생성됩니다 1,2. ROS의 천연 공급원과 달리 생체 이물, 감염원, 자외선, 오염, 흡연 및 방사선과 같은 특정 환경 요인은 세포 내 산화 스트레스의 핵심 동인인 ROS의 과도한 생성을 유발합니다 1,3. 세포 산화 스트레스가 증가하면 지질, 단백질, DNA와 같은 세포 내부의 생체 분자가 손상되어 암, 당뇨병, 심혈관 질환, 만성 염증 및 신경 퇴행성 질환과 같은 다양한 질병을 유발할 수 있습니다 1,3,4. 따라서 ROS의 정확한 측정은 산화 스트레스 유발 질병 병태생리학과 관련된 세포 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.
세포 내에서 ROS 생성 및 제거의 짧은 시간 척도로 인해 다양한 ROS 라디칼의 정량적 측정은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 전자 상자성 공명(EPR)5, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 형광 프로브 기반 이미징과 같은 방법을 사용하여 다양한 세포 ROS6를 측정합니다. EPR 및 HPLC와 같은 방법은 정량적으로 정확한 추정치를 산출하지만, 이러한 방법은 세포 공간 형태학의 파괴를 수반하며 일반적으로 샘플의 전체 및 대량 측정 형태입니다. 대조적으로, 형광 프로브 기반 방법과 같은 이미징 기반 방법은 ROS 생성의 세포 형태 및 공간적 맥락을 유지합니다. 그러나 다양한 유형의 ROS 라디칼에 대한 다양한 형광 프로브의 특이성은 잘 확립되지 않았습니다 7,8. 디하이드로에티듐(DHE), 디클로로디하이드로플루오레세인 다이아세테이트(DCFH-DA), 디하이드로로로다민(DHR), 디메틸 안트라센(DMA), 2,7 디클로로디하이드로플루레세인(DCFH), 1,3-디페닐이소벤조푸란(DPBF) 및 MitoSox와 같은 여러 형광 프로브를 ROS 검출에 상업적으로 사용할 수 있습니다. 지난 수십 년 동안 DHE, MitoSox 및 DCFH-DA는 세포 및 조직에서 ROS를 측정하는 데 일반적으로 사용되는 형광 염료입니다 8,9. DCFH-DA는 세포 내 H2O2 및 산화 스트레스를 검출하는 데 널리 사용되는 염료입니다. DCFH-DA의 인기에도 불구하고, 이전의 여러 연구에서는 세포 내 H2O2 및 기타 ROS 수준 8,9,10,11,12,13,14를 측정하는 데 안정적으로 사용할 수 없다는 것을 보여주었습니다.
대조적으로, 형광 프로브 디하이드로에티듐(DHE)은 세포 내 과산화물 라디칼(O2-)에 대한 특이적 반응을 나타낸다. 과산화물 라디칼은 세포에서 관찰되는 많은 ROS 종 중 하나이지만, 다른 세포 내 효과 중에서도 전이 금속의 환원, 과산화질산염으로의 전환, 하이드로퍼옥사이드의 형성에 관여하는 중요한 라디칼입니다. DHE는 세포에 의해 빠르게 흡수되고 적색 파장 범위15의 형광 방출을 갖습니다. 과산화물 라디칼과 특이적으로 반응하면 DHE는 적색 형광 생성물인 2-하이드록시 에티듐(2-OH-E+)을 형성합니다. 따라서, DHE는 과산화물 검출을 위한 특정 프로브로 간주될 수 있다. 그러나 DHE는 ONOO- 또는 OH., H2O2 및 시토크롬 c와 함께 비특이적 산화를 거쳐 두 번째 형광 생성물인 에티듐 E+를 형성할 수 있으며, 이는 측정된 2-OH-E+ 수준을 방해할 수 있습니다. 그러나 이러한 2-OH E+ 및 E+ 산물은 DHE로 염색할 때 세포 내에서 관찰되는 전체 세포 ROS 종의 주요 부분을 나타냅니다. E+는 DNA에 삽입되어 형광 8,9,10,11,13,14,15,16을 크게 향상시킵니다. 에티듐과 2-하이드록시 에티듐의 형광 스펙트럼은 약간만 다르기 때문에 과산화물 생산에 이차적인 세포에서 볼 수 있는 대부분의 ROS 수준은 DHE 형광 제품을 사용하여 검출 및 측정할 수 있습니다. 이러한 ROS 종은 480nm 파장 여기 및 610nm 파장 방출 15,16,17을 사용하여 식별됩니다.
특정 형광 ROS 검출 프로브를 선택하는 것 외에도 세포 내 ROS를 측정하기 위해 민감한 검출 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 따라서 세포 내 ROS 수준의 정확한 평가는 방사선, 독성 화합물 및 유전 독성 물질과 같은 다양한 환경 스트레스 요인에 노출된 병든 세포 또는 세포에서 발생하는 교란된 산화 환원 균형 상태를 식별하는 데 중요합니다18. ROS는 다양한 세포 신호 전달 활동을 조절하는 세포에서 흔히 발생하는 현상이기 때문에 ROS를 검출하는 강력한 방법이 필수적입니다. 세포 내 ROS 생산에 대한 이러한 고처리량 평가를 가능하게 하기 위해 이 프로토콜은 HCS(High-Content Screening) 플랫폼을 사용하여 ROS 종을 측정합니다. 현재 프로토콜은 세포 내 ROS 생산의 고처리량 분석을 가능하게 하며, 이는 많은 독성학 연구에서 매우 중요합니다19. 이 프로토콜은 부착성 간세포 암종 세포에서 세포 내 ROS를 검출하고 측정하기 위한 쉽고 다양한 솔루션을 제공하는 것을 목표로 합니다. H2O2 및 메나 디온의 화학 시약은 강력한 ROS 자극제로 사용되어 제어 된 높은 처리량 설정에서 ROS 생산의 상대적 수준을 측정합니다. 이 프로토콜은 필요에 따라 적절한 조건에서 부착 및 비부착 세포의 ROS 생성을 측정하도록 미세 조정될 수 있습니다.
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Protocol
1. 세포 배양
- 테스트 세포(HepG2, HUH7 및 JHH4 간세포 암종 세포)를 웰당 200μL의 최종 파종 부피에서 10,000 세포/웰의 파종 밀도로 96웰 플레이트에 파종합니다.
- HepG2 세포를 배양하기 전에 96개의 플레이트 웰을 IV형 콜라겐(50μg/mL)으로 실온(RT)에서 2시간 동안 코팅합니다. 원주 콜라겐의 응고를 방지하려면 원액을 얼음에 넣은 후 원하는 농도로 희석 과정을 시작합니다.
- 2시간의 배양 기간 후 여분의 콜라겐을 흡인하고 1x PBS로 웰을 세 번 씻습니다.
- 가습 인큐베이터에서 37°C 및 5%CO2 농도로 밤새 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 세포를 배양합니다.
- 다음날 또는 80 % -90 % 밀도에 도달하면 세포를 H2O2 (미처리, 250 μM, 500 μM, 750 μM 및 1000 μM) 및 Menadione (미처리, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM)으로 각각 30 분 동안 처리하여 대표적인 산화 스트레스를 유도합니다.
- 또는 세포 내에서 산화 스트레스를 유도할 수 있는 원하는 테스트 물질로 세포를 테스트하도록 선택합니다.
2. 세포의 DHE 염색을 위한 원액 및 희석 용액 준비
- 5mg의 DHE를 DMSO 1mL에 용해시켜 DHE 원액(5mg/mL 또는 15.9mM)을 준비합니다.
- DHE 원액을 이중 증류된 오토클레이브수로 최종 100μM 농도로 희석합니다.
- 염료의 동결 및 해동 과정(시간이 지남에 따라 형광 특성을 손상시킬 수 있음)을 피하려면 100μM 농도의 1.5mL 원심분리 튜브에 여러 부분 표본을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.
- 10μM의 최종 작업 농도를 얻으려면 100μM DHE 농도의 부분 표본을 사용하고 미리 데워진 DMEM 배지로 희석합니다.
알림: 작업 용액은 실험 당일에 신선하게 준비해야 합니다. - 염료의 적절한 혼합을 보장하기 위해 5-10초 동안 작동하는 형광 염료 용액을 소용돌이칩니다.
3. DHE 염색 공정
- 각 웰에서 약물 또는 테스트 물질이 함유된 배지를 제거하고 1x PBS 또는 DMEM으로 한 번 부드럽게 세척합니다.
참고: 실험에서 첨가 또는 세척 단계를 수행할 때 세포와 피펫터 사이의 직접적인 접촉을 피하는 것이 중요합니다. 이는 셀에 대한 잠재적인 기계적 손상을 최소화하기 위해 웰 측면을 따라 PBS를 부드럽게 피펫팅하여 달성할 수 있습니다. 피펫터가 세포에 직접 닿지 않도록 하면 실험 기간 동안 세포 무결성과 생존력을 유지하는 데 도움이 됩니다. - 10μM DHE(작업 용액)가 포함된 100μL의 DMEM 배지를 각 웰에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 30분 배양 기간 후 DHE 함유 배지를 제거하고 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 각각 부드럽게 세 번 잘 세척합니다. 이는 신속한 처리를 보장하기 위해 다중 채널 피펫터로 수행할 수 있습니다.
- 200μL의 1x PBS를 Hoechst 33342 핵 염색 염료로 각 웰에 RT에서 10분 동안 추가합니다.
- 웰에서 Hoechst 33342 핵 염색 용액을 제거하고 각 웰에 200μL의 1x PBS를 추가합니다.
참고: 고정 세포를 얻으려면 살아있는 세포와 동일한 프로토콜을 따르고, 처리 후 5분 동안 4% PFA를 추가하고 DHE 염색을 하는 한 단계를 추가로 수행합니다. PFA 용액을 제거하고 1x PBS로 셀을 세척합니다. 그런 다음 핵 염색 염료로 세포를 10분 동안 배양합니다. - 가능한 한 빨리 이미지를 획득하기 위해 플레이트를 high-content screening 플랫폼, fluorescence microscopy 또는 plate reader로 옮깁니다.
4. 이미지 획득 및 강도 측정
- 플레이트 로딩
- 데이터 수집을 위해 Cellomics CX7 High-Content Screening(HCS) 소프트웨어를 엽니다.
- 데이터의 흐릿하거나 흐릿한 이미지를 방지하기 위해 선택한 특정 96웰 플레이트를 사용하여 제조업체의 사양에 따라 이미징 플랫폼을 미리 신중하게 보정합니다.
참고: 다양한 공급업체의 멀티웰 플레이트는 서로 다른 재료 특성을 가질 수 있으며 얻은 최종 이미지의 품질에 영향을 줄 수 있습니다. - 교정이 완료되면 플레이트 브랜드와 관련된 시스템 파라미터를 기기 데이터베이스에 저장하고 향후 데이터 수집에 재사용할 수 있습니다.
- 준비된 샘플이 있는 플레이트를 HCS 이미징 시스템의 가열된 스테이지에 조심스럽게 놓습니다. 플레이트가 마이크로플레이트 홀더에 이미징을 위해 올바른 방향으로 단단히 배치되어 있는지 확인합니다(즉, 리더 스테이지에서 A1로 표시된 라벨을 찾은 다음 웰 A1의 위치가 스티커와 모서리와 일치하도록 마이크로플레이트를 회전).
- 마이크로플레이트를 부드럽게 눌러 s에 평평하게 놓이도록 합니다.tage. HCS 시스템에서 플레이트의 수평이 고르지 않으면 이미지 획득에 오류가 발생할 수 있습니다.
- 플레이트가 제자리에 놓인 후 Ctrl 키를 누른 상태에서 소프트웨어의 플레이트 로드/언로드 대화상자에서 Ctrl-OK 를 클릭합니다.
- 이미징 파라미터 선택
- HCS 이미징 시스템에서 Cellomics 바이오 애플리케이션 인터페이스의 Target Activation 모드를 열고 (a) 핵 염색 및 (b) DHE 형광 프로브 데이터 수집과 호환되는 2채널 설정 프로토콜을 사용하여 새 프로토콜을 생성합니다. 현재 프로토콜에서 필터 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS 및 386_BGS_RS는 각각 (a) Hoechst 33342 핵 염색, (b) 총 ROS 생산 및 (c) 과산화물 라디칼 검출에 사용되었습니다. 이러한 필터의 선택은 이 프로토콜의 일부로 사용되는 각 염료(DAPI 및 DHE)의 방출 특성에 대한 특정 중복에 의해 주도되었습니다.
참고: 필터의 명명 규칙(예: 386-23_BGRFRN_BGRFRN)은 23nm 대역폭의 386nm 광으로 샘플을 여기한 다음 특정 파장 범위에서 청색(B), 녹색(G), 적색(R), 원적외선(FR) 및 근적외선(N) 빛을 통과시키는 이색성 필터를 의미하며 386_BGS_RS는 이색성 이후에 BGS 및 RS 방출 파장을 통과시키는 방출 필터를 나타냅니다. - 필요에 따라 소프트웨어 프로토콜 인터페이스 내에서 이미지 획득 프로세스의 목표(예: 10x 또는 20x 배율)를 지정합니다.
- 실험에 필요한 이미징 세부 사항 및 해상도의 원하는 수준에 따라 적절한 대물렌즈 배율을 선택합니다. 그러나 각 목표의 해상도는 고정되어 있습니다. 해상도가 높을수록 플랫폼에서 대물렌즈를 변경해야 합니다. 현재 프로토콜에서는 20x, 0.45 NA 대물렌즈가 사용되며, 이는 이 프로토콜에 사용되는 high-content screening 플랫폼의 일부입니다.
참고: 20x 대물렌즈는 이미징 해상도 세부 사항과 시간 경과에 따른 ROS 변화를 캡처하는 데 필요한 획득 속도 간의 적절한 균형을 나타냅니다. 더 높은 배율의 대물렌즈(예: 40X)를 선택할 수 있지만, 이로 인해 획득 시간이 늘어납니다. - 프로토콜의 특정 요구 사항에 따라 노출 시간, 카메라 비닝, z-stack 간격과 같은 이미지 수집 카메라의 노출 설정을 지정합니다.
참고: 노출 시간(종종 밀리초 단위)은 사용된 특정 형광단의 신호 강도와 감도에 따라 다릅니다. 이것은 또한 염료 농도와 염색 품질에 따라 실험마다 약간 다를 수 있습니다. 현재 프로토콜에서 획득 매개변수는 목표 % - 35%, 이미지 획득 모드 - 1104 x 1104(2x2 비닝 포함) 및 목표 20x, 0.45NA로 고정되어 있습니다. 이러한 매개변수는 특정 실험 조건에 따라 설정될 수 있습니다.
- HCS 이미징 시스템에서 Cellomics 바이오 애플리케이션 인터페이스의 Target Activation 모드를 열고 (a) 핵 염색 및 (b) DHE 형광 프로브 데이터 수집과 호환되는 2채널 설정 프로토콜을 사용하여 새 프로토콜을 생성합니다. 현재 프로토콜에서 필터 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS 및 386_BGS_RS는 각각 (a) Hoechst 33342 핵 염색, (b) 총 ROS 생산 및 (c) 과산화물 라디칼 검출에 사용되었습니다. 이러한 필터의 선택은 이 프로토콜의 일부로 사용되는 각 염료(DAPI 및 DHE)의 방출 특성에 대한 특정 중복에 의해 주도되었습니다.
- 이미징 구성 매개 변수
알림: 이미징 매개변수가 설정되면 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 이미지 수집 프로세스를 시작할 수 있습니다.- 이미지 수집 매개 변수
- 기기에서 사용할 수 있는 다양한 알고리즘(광학 - isodata, fixed 및 triangle)을 사용하여 관심 있는 주요 추적 대상(세포의 핵)을 식별합니다.
참고: 기본 개체의 식별 및 표시를 위한 isodata 방법이 이 프로토콜에서 사용됩니다. - 물체(있는 경우)를 모양 또는 강도 매개변수로 분할합니다.
- 각 세포 유형에 고유한 원하는 크기, 모양 및 강도 매개변수를 기반으로 기본 개체를 검증합니다.
- 그런 다음, 이 기본 객체 주변의 '관심 영역'(ROI)을 정의합니다.
참고: ROI는 형광 염료의 강도가 세포 유형 전반에 걸쳐 일관되고 반복 가능한 것으로 식별되는 위치를 정의하는 데이터 수집의 핵심 파라미터입니다. ROI는 주요 파라미터(예: 염료의 강도)를 정의하며, 이는 기기의 서로 다른 채널에서 각 기본 추적 객체(즉, 셀)에 대해 측정됩니다. ROI는 각 세포의 핵 주위에 원 또는 고리의 형태로 정의될 수 있습니다. HCS 소프트웨어는 자동화된 방식으로 분할 및 분석되는 각 셀에 대한 ROI 한계 내에서 채널 2에서 DHE 형광 염료 마커의 강도를 자동으로 얻습니다. - 기본 물체(핵) 주위에 20μm 원을 설정합니다. 이 연구에서는 이 프로토콜에 사용된 다양한 세포주(HepG2, JHH-4 및 HUH-7)의 대략적인 크기를 기반으로 20μm의 거리를 선택했습니다. 세포 주위의 20μm 고리 ROI는 일관되고 반복 가능한 방식으로 형광 강도를 얻었습니다.
알림: ROI를 선택할 때 핵심 매개변수는 셀 영역을 적절하게 커버할 수 있는 능력입니다. 원형 ROI의 크기는 셀 크기에 따라 달라집니다. 셀이 클수록 ROI가 더 클 수 있으며 ROI가 작을수록 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 이러한 파라미터는 각 세포 유형 및 관심 형광 염료에 대해 미리 결정해야 합니다.
- 기기에서 사용할 수 있는 다양한 알고리즘(광학 - isodata, fixed 및 triangle)을 사용하여 관심 있는 주요 추적 대상(세포의 핵)을 식별합니다.
- 이미지 수집 매개 변수
- 모집단 특성화 및 저장할 피처 선택
- HCS 이미징 프로토콜에서 다양한 수집 파라미터가 정의되면 HCS 시스템을 데이터 수집 모드로 설정합니다.
- 이 프로토콜에 대한 이미지 획득 매개변수는 다음과 같이 설정되었습니다: 스캔 제한은 1000 셀/웰, 필드당 최소 요구 사항은 10개의 개체(셀)입니다.
참고: 각 웰에 대해 평가된 필드 수는 숫자 1000에 도달하는 최종 셀 수를 기준으로 결정되었습니다. HCS 시스템은 1000 세포/웰의 목표 모집단을 얻을 때까지 웰 내의 다양한 위치를 계속 검색합니다. 따라서 획득 속도는 96웰 플레이트의 각 웰에 존재하는 밀도 및 총 세포 수에 따라 달라집니다. 현재 프로토콜에서는 추가 다운스트림 분석을 위해 각 웰에서 채널 2의 총 강도 및 평균 강도(과산화물 라디칼 및 총 ROS 생성을 나타냄)를 수집했습니다.
- 이미지 캡처, 처리 및 분석
- 이미지 획득 파라미터를 조정하고 마무리한 후 각 96웰 플레이트에 대한 스캔 프로세스를 시작합니다.
참고: Cellomics CX7 이미징 시스템은 고처리량 방식으로 세포 내 ROS 생성을 포함하여 다양한 파라미터의 샘플에 대한 high-content 스크리닝 및 자동 분석을 가능하게 합니다. ROS 생산 외에도 HCS 시스템은 세포 형태, 세포 내 국소화 및 기타 많은 관심 세포 특징과 같은 다양한 파라미터에 대한 귀중한 추가 정보를 제공할 수 있습니다. 획득에 최적화되면 HCS 이미징 플랫폼을 통해 강력한 방식으로 세포 파라미터의 포괄적, 정성적, 정량적 특성 분석이 가능합니다. - 스캔 프로세스가 완료되면 뷰 분석 소프트웨어를 실행하고 추가 분석을 위해 다양한 정량적 데이터 매개변수를 .csv 형식으로 내보냅니다.
- 타사 소프트웨어를 사용하여 추가 다운스트림 분석을 위해 관심 있는 다양한 정량적 값을 복사하고 붙여넣습니다.
참고: 현재 프로토콜에서 GraphPad Prism 소프트웨어는H2O2및 메나디온 노출로 인한 유도 산화 스트레스에 대한 응답으로 DHE 강도 값을 분석하는 데 사용되었습니다.
- 이미지 획득 파라미터를 조정하고 마무리한 후 각 96웰 플레이트에 대한 스캔 프로세스를 시작합니다.
- 데이터 및 통계 분석
- 채널 2의 평균 강도(총 ROS 값과 과산화물 라디칼을 나타냄)를 계산합니다.
참고: 강도 값을 계산하기 위한 모든 실험은 각 투여 수준에서 조건당 6회 반복으로 3회 반복되었습니다. - 일원 분산 분석 또는 t-검정을 수행하여 다양한 테스트 조건 간의 명암 값 차이를 측정합니다.
- 채널 2의 평균 강도(총 ROS 값과 과산화물 라디칼을 나타냄)를 계산합니다.
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Representative Results
디하이드로에티듐(DHE)은 세포 내 ROS 상태에 관한 특정 정보를 제공하는 과산화물 반응성 형광 염료입니다. DHE 염료는 본질적으로 세포질에서 청색 형광을 방출합니다. 그러나 과산화물 라디칼과 상호 작용하면 2-하이드록시티듐으로 변환되어 적색 파장(>550nm)에서 형광을 방출합니다(그림 1). DHE 염료는 세포와 핵으로 쉽게 운반됩니다. 방출되는 형광은 많은 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 형광 현미경 설정으로 시각화할 수 있습니다. 이번 연구에서는 ROS 종 생성의 프로브로서 HUH7, JHH4 및 HepG2 세포와 같은 여러 간세포 암종 세포주에 대한 DHE 염료의 유용성을 high-content screening 플랫폼에서 테스트했습니다. 세포를 두 가지 ROS 생성제인 (a) 과산화수소 및 (b) 메나디온으로 용량 의존적 방식으로 30분 동안 처리하여(투여 세부 사항은 그림 2 및 그림 3 참조) 세포에서 산화 스트레스를 유도한 후 96웰 플레이트에서 DHE 염료 라벨링을 수행했습니다. H2O2및 메나디온은 모두 용량 의존적 방식으로 3개의 세포주 모두에서 형광 강도를 극적으로 증가시켰습니다. 고처리량 스크리닝 플랫폼 내에서 이미지 분할 및 정량화 알고리즘을 사용하여 ROS 유도 DHE 형광의 강도를 6번의 반복에 걸쳐 웰당 1,000개 셀로 정량화했습니다. 3개의 독립적인 반복실험을 측정하고 결과를 집계 및 분석했습니다. Hoechst 33342 핵 염색은 부착 세포가 각 웰에 존재하는 평면을 식별하는 데 중요한 역할을 합니다. 또한 2-OH-E+ 및 E+ 형광은 고처리량 스크리닝 플랫폼에서 각각 테스트된 세포의 핵과 세포질 모두에서 검출할 수 있습니다(그림 4 참조).
H2O2에 노출된 결과, 용량 의존적 방식으로 분석된 모든 세포주에 걸쳐 ROS-유도 형광이 통계적으로 유의하게 증가하였다(도 2; 하단 패널 참조). 그러나, 그런 용량 의존하는 반응은 menadione 노출의 경우에는 보이지 않았다. 메나디온의 경우, JHH4 세포주는 형광 강도의 용량 의존적 증가를 보인 반면, HepG2 및 HUH7 세포주에서는 더 높은 메나디온 농도에서만 형광 강도의 상당한 차이가 관찰되었습니다(그림 3 참조, 하단 패널). ROS 생성 반응의 이러한 차이는H2O2및 메나디온의 ROS 생산의 뚜렷한 메커니즘 때문일 수 있습니다. H2O2는 보다 직접적인 방식으로(예: 과산화효소 및 카탈라아제와 같은 항산화 효소의 작용을 통해) 세포에서 ROS 형성을 유발하는 반면, 메나디온은 유도된 미토콘드리아 기능 장애를 통해 간접적인 방식으로 ROS 종을 생성하는 것으로 가설됩니다. ROS 생성의 간접적인 메커니즘으로 인해 DHE 형광은 메나디온으로 나타나는 데 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 이러한 결과는 ROS 의존성 DHE 형광이 산화 스트레스 노출 기간, 농도 및 세포 유형에 민감하다는 것을 나타냅니다. 따라서 각 고유 세포 유형에 대한 실험 프로토콜의 최적화는 필수입니다. 더 중요한 것은 이 프로토콜이 독성학, 암 생물학 및 약물 스크리닝과 같은 분야에서 사용되는 고처리량 방식으로 DHE 염료를 ROS 검출제로 사용할 수 있음을 입증한다는 것입니다.
그림 1: DHE 형광 분자가 각각 2-하이드록시에티듐(2-OH-E+) 및 에티듐(E+)으로 산화적으로 전환되는 경로를 보여주는 개략도. 2-OH-E+ 및 E+ 의 형광 방출 스펙트럼은 480nm의 여기(excitation)에서 중첩됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 과산화수소 처리는 용량 의존적 방식으로 세포 내 ROS 수준을 증가시킵니다. 간세포 암종 세포 - (A) HUH7, (B) JHH4 및 (C) HepG2를 30분 동안 250μM, 500μM, 750μM 및 1000μM의 용량으로H2O2로 처리하였다. 세포를 배양 배지에서 DHE(10μM) 염료로 추가로 30분 동안 염색한 후 Hoechst 33342 핵 염색을 수행했습니다. 총 1000개의 세포가 각 웰에서 계수되었습니다. DHE 형광의 선형적이고 용량에 따른 증가가 3개의 세포주 모두에서 관찰됩니다(상단 패널). 통계적으로 유의미한 형광 증가는 500μM 이상의 투여에 대한 모든 세포주에서 관찰됩니다(하단 패널). 각 데이터 세트는 3개의 독립적인 실험(n = 3)에서 얻은 96웰 플레이트의 평균 6회 반복실험입니다. 처리 조건은 일원 분산 분석(**** - p < 0.0001, *** - p < 0.001; 이미지 스케일 바 - 50μm)을 사용하여 처리되지 않은 샘플과 비교되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 메나디온 치료는 용량에 따라 세포 내 ROS 수치를 증가시킵니다. 간세포 암종 세포 - (A) HUH7, (B) JHH4 및 (C) HepG2를 30분 동안 25μM, 50μM, 75μM 및 100μM의 용량으로 메나디온으로 처리했습니다. 세포를 배양 배지에서 DHE(10μM) 염료로 추가로 30분 동안 염색한 후 Hoechst 33342 핵 염색을 수행했습니다. 총 1000개의 세포가 각 웰에서 계수되었습니다. DHE 형광의 선형적이고 용량에 따른 증가가 3개의 세포주 모두에서 관찰됩니다(상단 패널). 통계적으로 유의미한 형광 증가는 최대 선량(100μM, 하단 패널)에서 일관되게 나타납니다. 가변성은 다른 세포주 (JHH4 > HUH7 > HepG2)에 걸쳐 menadione의 잔여 복용량에 대해 관찰됩니다. 각 데이터 세트는 3개의 독립적인 실험(n = 3)에서 얻은 96웰 플레이트의 평균 6회 반복실험입니다. 처리 조건은 일원 분산 분석 검정(**** - p < 0.0001, *** - p < 0.001; 이미지 스케일 막대 - 50μm)을 사용하여 처리되지 않은 샘플과 비교되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 단일 세포 DHE 형광 - (A) 과산화수소 및 (B) 메나디온으로 30분 동안 처리한 후 관찰된 DHE 형광 변화를 자세히 나타낸 모습. DHE 형광의 세포질 및 핵 변화는 다른 세포에서 관찰됩니다. High-Content Screening Platform에서 생성된 자동 분할 마스크도 볼 수 있습니다. 이미지 스케일 바 - 10μm. 배율 - 20x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 과산화수소에 반응하는 과산화물 구동 DHE 형광 이미징. 간세포 암종 세포 - (A) HUH7, (B) JHH4 및 (C) HepG2를 30분 동안 250μM, 500μM, 750μM 및 1000μM의 용량으로H2O2로 처리하였다. 그런 다음 세포를 배양 배지에서 DHE(10μM) 염료로 추가로 30분 동안 염색했습니다. 이어서 세포를 386nm LED로 조명하고 >560nm에서 형광 이미징을 수집했습니다. 스펙트럼 혼선을 피하기 위해 핵 카운터 염색을 수행하지 않았습니다. DHE 형광의 용량 의존적 증가는 500μM > 용량에서 관찰되며, UV 조명 DHE 형광은 과산화물 라디칼 생성의 대부분에 기인할 것으로 예상됩니다. 각 데이터 세트는 두 개의 독립적인 실험(n = 2)에서 얻은 96웰 플레이트의 평균 6회 반복실험입니다. 처리 조건은 일원 분산 분석(**** - p < 0.0001, *** - p < 0.001; 이미지 스케일 바 - 50μm)을 사용하여 처리되지 않은 샘플과 비교했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 메나디온에 반응하는 과산화물 구동 DHE 형광 이미징 - 간세포 암종 세포 - (A) HUH7, (B) JHH4 및 (C) HepG2를 30분 동안 25μM, 50μM, 75μM 및 100μM의 용량으로 메나디온으로 처리했습니다. 그런 다음 세포를 배양 배지에서 DHE(10μM) 염료로 추가로 30분 동안 염색했습니다. 과산화수소와 유사하게, DHE 형광의 용량 의존적 증가가 관찰되었습니다. 각 데이터 세트는 두 개의 독립적인 실험(n = 2)에서 얻은 96웰 플레이트의 평균 6회 반복실험입니다. 처리 조건은 일원 분산 분석(**** - p < 0.0001, *** - p < 0.001; 이미지 스케일 바 - 50μm)을 사용하여 처리되지 않은 샘플과 비교했습니다 . 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서는 디하이드로에티듐(DHE) 형광 염료를 사용하여 과산화물 구동 세포 내 활성 산소종(ROS) 생산을 평가하는 프로토콜을 고함량 스크리닝 시스템에 설정했습니다. 문헌에서 사용할 수 있는 대부분의 현재 프로토콜은 ROS 종을 정량화하기 위한 형광 이미징 프로브로 DCFH-DA를 사용합니다. 그러나 여러 연구에 따르면 DCFH-DA는 세포 내 ROS 측정에 이상적인 프로브가 아닙니다. 프로브로서 DCFH-DA의 부적합성에 대해 가정된 여러 가지 이유는 다음과 같습니다 - (i) DCFH-DA는H2O2와 직접적인 반응을 나타내지 않으며, 이는 세포내H2O2수준을 평가하는데 부적절한 염료가 된다. (ii) OH., NO2. 및 ONOO-와 같은 여러 단일 전자 산화 종은 DCFH를 DCF로 산화시킵니다. (iii) 전이 금속, 시토크롬 C 및 헴 퍼옥시다아는 산소 및H2O2의 존재 하에서 DCFH 산화를 촉진할 수 있다. (iv) 가장 중요한 것은, DCFH-DA는 중간 생성물 DCFH를 생성한다.--/DCF., 산소의 존재 하에서, 추가적인 과산화물의 생성을 유도한다. O2.-에 의한 변이는 추가적인H2O2를 생성하며, 이로 인해 형광 강도가 인공적으로 증가하고 ROS 수준이 잘못 상승할 수 있습니다. 여러 저자는 DCFH-DA를 세포 내 H2O2 및 기타 ROS 종 8,9,10,11,12,13,14의 검출을 위한 신뢰할 수 없는 형광 프로브로 사용하는 것으로 간주했습니다.
DCFH-DA와 달리 DHE는 과산화물 라디칼과 특이적으로 반응하여 형광 생성물인 2-하이드록시티듐(2-OH E+)을 생성합니다. 비과산화물 ROS 종은 DHE와 반응하여 두 번째 형광 생성물인 에티듐(E+)을 생성할 수도 있습니다. 2-OH-E+와 E+의 형광 스펙트럼은 비교적 유사하지만, 이 두 분자는 세포 내 ROS 종과 DHE 간의 특정 상호 작용의 최종 산물을 나타내며 산화 스트레스로 인해 세포 내에서 관찰되는 총 형광 강도를 담당합니다. 일부 연구에 따르면 더 짧은 UV 범위 파장(<400nm)에서의 선택적 여기가 2-OH 에티듐 여기(E+와 반대)에 대해 더 특이적일 수 있으므로 과산화물 라디칼 생성 7,12,14. 이것은 386nm LED 광만으로 세포를 여기시켜 평가되었습니다. 480nm 파장 여기와 관련하여 560nm 파장에서 감소된 방출 강도가 관찰되었습니다(보충 그림 1 및 보충 그림 2 참조). 그러나 이것이 2-OH 에티듐 형광 때문인지 확신할 수 없으며 현재 접근 방식의 잠재적인 단점을 나타냅니다. 다른 연구에 따르면 UV 여기(예: 386nm)는 2-OH 에티듐 7,15에 비해 낮은 수준이지만 동시 에티듐 형광 방출을 초래할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 당사의 프로토콜은 high-content 이미징 및 스크리닝 시스템을 사용하여 대부분의 세포 내 ROS 생산의 정량적 차이를 측정하기 위한 더 나은 염료 대안으로 DHE를 확립합니다.
ROS 생성의 중간 동인(DCFH-DA에서 볼 수 있는 것과 같은)의 부족은 세포 내 ROS 생산을 평가하기 위해 DHE를 사용하는 데 있어 주요 이점으로 가정됩니다. 그러나 이러한 DHE 형광 메커니즘은 아직 확고하게 확립되어 있지 않습니다. ROS 수준의 정확한 정량화가 필요한 경우 HPLC 및/또는 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS) 방법과 같은 정량적 검증을 위한 추가 직교 방법을 사용하여 세포 내 2-OH-E+ 수준을 정확하게 추정하는 것이 좋습니다 8,9,13. 그러나 HPLC 및 LC-MS 분석법은 평가를 위해 세포의 응집 및 가용화를 반드시 수반한다는 점을 알고 있어야 합니다. 따라서 현재 프로토콜에서와 같이 형광 기반 이미징 방법으로 인코딩된 시공간 정보는 HPLC 및 LC-MS에서 손실되며 이미징 기반 ROS 평가 방법의 주요 이점을 나타냅니다. DHE의 적색 편이 형광의 또 다른 장점은 파장이 긴 빛(빨간색)이 적색광에 의해 전달되는 에너지가 적기 때문에 세포에 대한 독성이 적다는 것입니다.
상대적인 세포 내 ROS 변화를 측정하기 위한 DHE 형광의 용량 의존적 특성은 산화 스트레스 유도제로 메나디온과 과산화수소를 사용하여 테스트되었습니다. 메나디온과 과산화수소는 ROS의 다양한 메커니즘과 산화 스트레스 생성20,21로 인해 시험 물질로 선택되었습니다. 메나디온 노출로 인한 ROS 생성은 간접적 인 (미토콘드리아 기능 장애를 통해)이지만 H2O2 는보다 직접적인 방식으로 산화 스트레스를 생성합니다. 메나디온의 농도가 증가하면 선형, 반복 가능, 용량 의존적 방식으로 DHE 형광 생산이 향상되었습니다. 메나 디온과 유사하게, H2O2 는 펜톤 화학을 통해 직접 히드 록실 라디칼 (OH)을 생성 할 수있는 ROS의 잘 알려진 유도 인자이다22. 선형 및 용량 의존적 반응은H2O2노출로 인한 DHE 형광에서 유사하게 관찰되었습니다. 특히 과산화물 라디칼에 대한 DHE의 선택성으로 인해H2O2와 직접 반응하지 않습니다. 대신에, 생성된 세포 내 과산화물 라디칼은 처음에H2O2와 반응하여 하버-바이스 및 펜톤 반응을 통해 하이드록시 라디칼과 같은 2차 ROS 종을 형성한 다음 DHE 형광23에 의해 검출됩니다. 세포 내 ROS 생산의 대부분을 측정하여 두 가지 다른 산화 물질에 반응하는 DHE의 형광 방출 스펙트럼은 현재 프로토콜 8,13에서 설정됩니다. 이러한 결과는 고처리량 스크리닝 접근법을 사용하여 세포 내 ROS 수준의 검출 및 정량화를 위한 더 나은 대안으로서 형광 DHE 염료의 유용성을 입증합니다.
DHE의 우수한 선택성, 감도 및 광학적 특성은 현재 프로토콜에 확립된 바와 같이 고처리량 방식으로 ROS 생성 및 산화 손상을 조사하는 데 유용한 대안이 됩니다. 우리 연구실의 향후 연구에서는 고처리량 설정에서 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 ROS와 세포 신호 메커니즘 간의 교차 반응에서 ROS 마커로서 DHE의 역할을 탐구할 것입니다.
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Disclosures
저자는 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언한다.
Acknowledgments
RK와 RRG는 NIH NIGMS 보조금 P20 GM130422를 통해 UNM CMBM(Center for Metals in Biology and Medicine)의 보조금으로 지원되었습니다. RRG는 NM-INSPIRES P30 보조금 1P30ES032755의 파일럿 상을 지원받았습니다. CX7 Cellomics 기기에 대한 이미징 코어 지원은 NIH 보조금 P20GM121176 자금을 지원하는 AIM 센터 코어를 통해 제공되었습니다. CX7 Cellomics 이미징 플랫폼 사용과 관련된 기술적 문제에 대해 귀중한 도움을 주신 Sharina Desai 박사와 Li Chen 박사님께 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press, Oxford Academic. USA. (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham,, et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
