Summary
Denne eksperimentelle protokollen beskriver og optimaliserer en multiplex immunhistokjemi (IHC) fargemetode, hovedsakelig ved å optimalisere enkeltkanals antistoffinkubasjonsbetingelser og justere innstillingene for antistoffer og kanaler for å løse problemene med autofluorescens og kanalkrysstale i lungekreftvev av klinisk opprinnelse.
Abstract
Lungekreft er den ledende årsaken til ondartet tumorrelatert sykelighet og dødelighet over hele verden, og det komplekse tumormikromiljøet har blitt ansett som den ledende dødsårsaken hos lungekreftpasienter. Kompleksiteten i tumormikromiljøet krever effektive metoder for å forstå celle-til-celle-forhold i tumorvev. Multiplex immunhistokjemi (mIHC) teknikken har blitt et sentralt verktøy for å utlede forholdet mellom ekspresjon av proteiner oppstrøms og nedstrøms for signalveier i tumorvev og utvikling av kliniske diagnoser og behandlingsplaner. mIHC er en multi-label immunfluorescensfargemetode basert på Tyramine Signal Amplification (TSA) teknologi, som samtidig kan oppdage flere målmolekyler på samme vevssnittprøve for å oppnå forskjellig proteinekspresjon og samlokaliseringsanalyse. I denne eksperimentelle protokollen ble parafin-innebygde vevsseksjoner av lungeplateepitelkarsinom av klinisk opprinnelse utsatt for multiplex immunhistokjemisk farging. Ved å optimalisere den eksperimentelle protokollen ble multiplex immunhistokjemisk farging av merkede målceller og proteiner oppnådd, og løste problemet med autofluorescens og kanal crosstalk i lungevev. I tillegg er multiplex immunhistokjemisk farging mye brukt i eksperimentell validering av tumorrelatert, høy gjennomstrømningssekvensering, inkludert enkeltcellesekvensering, proteomikk og vevsromsekvensering, noe som gir intuitive og visuelle patologiske valideringsresultater.
Introduction
Tyraminsignalforsterkning (TSA), som har en historie på mer enn 20 år, er en klasse av analyseteknikker som bruker pepperrotperoksidase (HRP) for høy tetthet in situ-merking av målantigener og brukes mye i enzymbundne immunosorbentanalyser (ELISA), in situ-hybridisering (ISH), immunhistokjemi (IHC) og andre teknikker for påvisning av biologiske antigener, vesentlig forbedring av følsomheten til det oppdagede signalet1. Opal polykromatisk farging basert på TSA-teknologi har nylig blitt utviklet og mye brukt i flere studier 2,3,4,5. Tradisjonell immunfluorescens (IF) farging gir forskere et enkelt verktøy for påvisning og sammenligning av fordelingen av proteiner i celler og vev av ulike modellorganismer. Den er basert på antistoff-/antigenspesifikk binding og inkluderer direkte og indirekte tilnærminger6. Direkte immunfarging innebærer bruk av et fluoroforkonjugert primært antistoff mot antigenet av interesse, noe som muliggjør direkte fluorescerende deteksjon ved bruk av et fluorescensmikroskop. Den indirekte immunfargingsmetoden innebærer anvendelse av et fluoroforkonjugert sekundært antistoff mot det ukonjugerte primære antistoffet 6,7.
Tradisjonelle, single-label, immunfluorescensfargemetoder kan bare flekke ett, to eller i noen tilfeller tre antigener i vev, noe som er en stor begrensning i gruvedrift av den rike informasjonen som finnes i vevseksjoner. Tolkningen av kvantitative resultater avhenger ofte av visuell observasjon og nøyaktig kvantifisering av bildebehandlingsprogramvare, for eksempel ImageJ. Det er tekniske begrensninger, for eksempel antistoffartsbegrensning, svake fluorescerende etikettsignaler og fluorescerende fargefargefargekollaps (tabell 1). Opal multiplex IHC (mIHC) -teknikken er basert på TSA-derivasjon, som tillater multipleksfarging og differensialmerking av mer enn 7-9 antigener på samme vevsseksjon, uten begrensning på opprinnelsen til det primære antistoffet, men krever høy spesifisitet av det tilsvarende antistoffet mot antigenet. Fargeprosedyren ligner på normal immunfluorescensfarging, bortsett fra to forskjeller: hver fargingsrunde innebærer bruk av bare ett antistoff og et antistoffelueringstrinn tilsettes. Antistoffer bundet til antigenet ved ikke-kovalente bindinger kan fjernes ved mikrobølgeeluering, men TSA-fluorescerende signal bundet til overflaten av antigenet ved kovalente bindinger beholdes.
Aktiverte tyramin (T) molekyler merket med fargestoffet er svært beriket ved målantigenet, noe som muliggjør effektiv forsterkning av det fluorescerende signalet. Dette tillater direkte merking av antigenet uten antistoffinterferens, og deretter kan flerfarget merking oppnås etter flere fargesykluser 8,9,10 (figur 1). Selv om denne teknologien produserer pålitelige og nøyaktige bilder for studiet av sykdom, kan opprettelsen av en nyttig multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) fargestrategi være tidkrevende og krevende på grunn av behovet for omfattende optimalisering og design. Derfor har denne multiplekspanelprotokollen blitt optimalisert i en automatisert IHC-farget med kortere fargetid enn den manuelle protokollen. Denne tilnærmingen kan brukes direkte og tilpasses av enhver forsker for immunonkologistudier på humane formalinfaste og parafininnebygde (FFPE) vevsprøver11. Videre vil metodene for lysbildepreparering, antistoffoptimalisering og multiplexdesign være nyttige for å skaffe robuste bilder som representerer nøyaktige cellulære interaksjoner in situ og for å forkorte optimaliseringsperioden for manuell analyse12.
MFIHC inkluderer hovedsakelig bildeinnsamling og dataanalyse. Når det gjelder bildeinnsamling, må flerfargemerkede kompleksfargede prøver detekteres med profesjonelt spektralt bildebehandlingsutstyr for å identifisere de forskjellige blandede fargesignalene og oppnå høye signal-til-støy-bilder uten forstyrrelser fra vevsautofluorescens. Nåværende utstyr for spektral avbildning omfatter hovedsakelig spektrale konfokale mikroskoper og multispektrale vevsavbildningssystemer. Det multispektrale vevsbildesystemet er et profesjonelt bildebehandlingssystem designet for kvantitativ analyse av vevssnitt, og den viktigste funksjonen er oppkjøpet av bildespektral informasjon, som gir både morfologisk struktur og optisk kartleggingsinformasjon av biologiske vevsprøver13,14. Enhver piksel i spektralbildet inneholder en komplett spektralkurve, og hvert fargestoff (inkludert autofluorescens) har sitt tilsvarende karakteristiske spektrum, noe som muliggjør fullstendig opptak og nøyaktig identifisering av blandede og overlappende multilabel-signaler.
Når det gjelder dataanalyse, er flerfargede merkede prøver ekstremt komplekse på grunn av den morfologiske strukturen og bestanddelene i vevsprøvene. Vanlig programvare kan ikke automatisk identifisere ulike vevstyper. Derfor brukes intelligent kvantitativ vevsanalyseprogramvare for kvantitativ analyse av antigenuttrykk i spesifikke regioner 15,16,17,18.
Fremfor alt har multilabel immunfluorescensfarging smeltet sammen med multispektral avbildning og kvantitativ patologianalyseteknologi fordelene med et stort antall deteksjonsmål, effektiv farging og nøyaktig analyse, og det kan derfor forbedre nøyaktigheten av histomorfologisk analyse betydelig, avsløre det romlige forholdet mellom proteiner med oppløsning på cellenivå, og bidra til å utvinne rikere og mer pålitelig informasjon fra vevssnittprøver19 (Tabell 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er godkjent av retningslinjene til etikkomiteen ved West China Hospital, Sichuan University, Kina. Lungekreftvevsprøvene ble oppnådd under operasjon i Center of Lung Cancer ved West China Hospital, og informert samtykke ble innhentet fra hver pasient.
1. Forberedelse av vevsseksjon
- FFPE forberedelse
- Dypp klinisk vev i nøytral formalinløsning i mer enn 72 timer.
- Fullfør prosessen med å dehydrere vevet ved hjelp av xylen og graderte alkoholholdige løsninger20.
- Utfør manuell parafininnstøping og vevsseksjonering ved 4 μm seksjonstykkelse. Bruk adhesjonsmikroskopglass for å sikre at vevskivene ikke faller ut.
- Stek lysbildene i ovn ved 65 °C i 2 timer for å sikre at vevet og lysbildene er tørre. Oppbevares i en lysbildeboks ved romtemperatur.
- Forbehandling av vevsseksjon
- Forbehandle vevslysbildene i en ovn ved 65 ° C i 5 minutter, og senk deretter sekvensielt i xylenløsninger i 2 x 15 minutter, vannfrie etanolløsninger i 2 x 15 min, 90% etanoloppløsning i 10 minutter, 85% etanolløsning i 10 minutter, 80% etanoloppløsning i 10 minutter og 75% etanoloppløsning i 10 minutter, etterfulgt av å vaske lysbildene med sterilisert vann i 3 x 1 min.
MERK: Denne eksperimentelle teknikken kan bare brukes til FFPE-vev, ikke for frosset eller ferskt vev, da multippel antigenreparasjonsprosess med høy temperatur fører til at vevet faller av lysbildet.
- Forbehandle vevslysbildene i en ovn ved 65 ° C i 5 minutter, og senk deretter sekvensielt i xylenløsninger i 2 x 15 minutter, vannfrie etanolløsninger i 2 x 15 min, 90% etanoloppløsning i 10 minutter, 85% etanolløsning i 10 minutter, 80% etanoloppløsning i 10 minutter og 75% etanoloppløsning i 10 minutter, etterfulgt av å vaske lysbildene med sterilisert vann i 3 x 1 min.
2. Optimalisering av primært antistoff
MERK: Konvensjonelle IHC-eksperimenter ble brukt til å bestemme inkubasjonsbetingelsene for individuelle antistoffer, hovedsakelig inkludert antistoffkonsentrasjon og antigenreparasjonsbetingelser. Se betingelsene i antistoff bruksanvisningen.
- Bruk en antistoffkonsentrasjon litt høyere enn det anbefalte konsentrasjonsområdet og mellomverdiene.
- Optimaliser antigengjenfinningsbufferrutinene PH6 og PH9 i henhold til plasseringen av proteinuttrykk. Bruk PH9 for proteiner uttrykt i kjernen og bruk enten rutinemessig (PH6 eller PH9) for andre proteiner.
3. mIHC fargemetode
MERK: Opal mIHC-farging er en av de tilgjengelige mIHC-metodene. I denne eksperimentelle 5-fargeprotokollen, da hver vevsprøve må farges med fire antistoffer, er det nødvendig med fire primære antistoffinkubasjoner, sekundære antistoffinkubasjoner og TSA-signalforsterkning, kromogene inkubasjoner, samt fem antigenrestaureringer. Til slutt utføres 4'6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) farging og antifluorescerende sprengningsmiddelforsegling.
- Hoved reagens forberedelse
MERK: Bestem mengden reagens som skal tilsettes i henhold til størrelsen på vevslysbildene. Bruk nok volum til å dekke vevsseksjonen helt (vanligvis 50-150 μL per lysbilde). Arbeidsløsningene som kreves for forsøket er utarbeidet som følger:- Vaskebuffer arbeidsløsning: fortynn 20x Vask buffer på 1:20 med dobbeltdestillert vann, og oppbevar ved romtemperatur.
- PH6-bufferarbeidsløsning: Fortynn 100x PH6-buffer ved 1:100 med dobbeltdestillert vann. Forbered før bruk og oppbevar ved romtemperatur.
- PH9-bufferarbeidsløsning: Fortynn 50x PH9-buffer ved 1:50 med dobbeltdestillert vann. Forbered før bruk og oppbevar ved romtemperatur.
- Polymer HRP: Forbered denne bruksklare løsningen bare for primære antistoffer av kanin og mus opprinnelse.
- Fluorofor arbeidsløsning: Rekonstituer hvert fluoroforpulver (unntatt fluorofor 780) i 75 mikroliter DMSO. Før hver prosedyre, fortynn fluoroforen i 1x amplifikasjonsfortynningsmiddel ved 1:100. Kast ubrukte deler av fluoroforens arbeidsløsning.
- Fluorofor 780 Arbeidsløsning: Rekonstituer TSA-DIG i 75 μL DMSO og fluoroforpulveret 780 i 300 μL dobbeltdestillert vann. Før prosedyren, fortynn TSA-DIG i 1x amplifikasjonsfortynningsmiddel ved 1:100, og fortynn fluorofor 780 med Ab-fortynningsmiddel ved 1:25.
- DAPI-arbeidsløsning: Fortynn DAPI-løsningen ved 1:50 med dobbeltdestillert vann eller PBS. Tilberedes før bruk og oppbevares ved 4 °C i høyst 48 timer.
NOTAT. Vask lysbildene bare med dobbeltdestillert vann og nylaget vaskebufferarbeidsløsning gjennom dette multilabel fluorescensfargingseksperimentet. Vevsseksjoner må ikke komme i kontakt med vann fra springen; Forurensninger i kranvannet kan feste seg til vevsseksjonene og forårsake autofluorescens. Hold prøvene borte fra lys gjennom hele eksperimentet.
- Uthenting av antigen
- Plasser lysbildene i en farge- og reparasjonsboks og fyll den med PH6- eller PH9-bufferarbeidsløsning, dekk til med lokket og varm opp i en mikrobølgeovn i 2 x 8 minutter ved 100% strøm.
NOTAT: Tilsett dobbeltdestillert vann i reparasjonsboksen under oppvarmingsprosessen for å forhindre overdreven fordampning som kan føre til at skivene tørker ut. - La skliene avkjøles i romtemperatur før du fortsetter (30-60 min).
- Vask lysbildene 3 x 2 min med dobbeltdestillert vann. Bruk en hydrofob barrierepenn til å omringe vevsdelen på lysbildet.
- Plasser lysbildene i en farge- og reparasjonsboks og fyll den med PH6- eller PH9-bufferarbeidsløsning, dekk til med lokket og varm opp i en mikrobølgeovn i 2 x 8 minutter ved 100% strøm.
- Blokkerer
- Dyp vevseksjoner i vaskebuffer, deksel med blokkeringsløsning og inkuber lysbilder i et fuktet kammer ved romtemperatur i 10 minutter.
- Primær antistoffinkubasjon
- Fjern blokkeringsløsningen fra lysbildene og dekk vevsseksjonene med den primære antistoffarbeidsløsningen. Inkuber lysbildene i et fuktet kammer i 1 time ved 37 °C i inkubatoren eller over natten ved 4 °C i kjøleskapet.
MERK: Ikke la lysbildene tørke ut.
- Fjern blokkeringsløsningen fra lysbildene og dekk vevsseksjonene med den primære antistoffarbeidsløsningen. Inkuber lysbildene i et fuktet kammer i 1 time ved 37 °C i inkubatoren eller over natten ved 4 °C i kjøleskapet.
- Innføring av polymer HRP
- Vask lysbildene i vaskebufferarbeidsløsning i 3 x 2 min. Tilsett polymer HRP direkte dråpevis til vevsseksjoner og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
MERK: For lysbilder som oppbevares i kjøleskapet, oppbevar dem i romtemperatur i ca. 30 minutter før vask for å fjerne det primære antistoffet.
- Vask lysbildene i vaskebufferarbeidsløsning i 3 x 2 min. Tilsett polymer HRP direkte dråpevis til vevsseksjoner og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
- Generering av tyraminsignalforsterkning (TSA)
- Vask lysbildet med vaskebufferarbeidsløsning i 3 x 2 min, tilsett fluoroforarbeidsløsningen direkte dråpevis til vevsseksjonene, og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Vask lysbildet med vaskebuffer arbeidsløsning i 3 x 2 min.
- Spesiell prosedyre for fluorofor 780
MERK: Fluorofor 780 er svak og plasseres rutinemessig sist i fargeavstemmingsskjemaet for hele eksperimentet. Fluorofor 780 brukes normalt ikke i denne eksperimentelle protokollen, men på grunn av dens spesifisitet er dens eksperimentelle trinn oppført.- Introduksjon av TSA-DIG
- Vask lysbildet med vaskebufferarbeidsløsning i 3 x 2 min, tilsett TSA-Drg arbeidsløsning dråpevis til vevsseksjonene, og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.
- Mikrobølgeovn behandling
- Vask lysbildene med vaskebuffer arbeidsløsning i 3 x 2 min.
- Plasser lysbildene i en farge- og reparasjonsboks, fyll den med reparasjonsløsning, dekk til med lokket og varm opp i en mikrobølgeovn i 2 x 8 min ved 100% effekt. La skliene avkjøles i romtemperatur før du fortsetter (30-60 min).
- Vask lysbildene i 3 x 2 min med dobbeltdestillert vann.
- Fluorofor 780 signalgenerering
- Fordyp seksjonene i vaskebuffer, dekk med fluorofor 780 arbeidsløsning, og inkuber lysbildene i et fuktet kammer i 1 time ved romtemperatur.
- Vask lysbildene med vaskebuffer arbeidsløsning i 3 x 2 min.
MERK: IKKE utfør mikrobølgebehandling etter dette trinnet.
- Bruk fluorofor 780 som det siste trinnet i hele arbeidsflyten, og flekk deretter kjerner direkte med DAPI-arbeidsløsningen.
MERK: Hopp over trinn 3.7 hvis du ikke bruker fluorofor 780.
- Introduksjon av TSA-DIG
- Mikrobølgeovn behandling
MERK: Dette mikrobølgetrinnet stripper det primær-sekundære HRP-komplekset og eksponerer antigener på nytt, slik at det neste primære antistoffet kan introduseres.- Plasser lysbildene i en farge- og reparasjonsboks, fyll den med PH6- eller PH9-bufferarbeidsløsning, dekk til med lokket og varm opp i mikrobølgeovn i 2 x 8 minutter ved 100% effekt.
- La skliene avkjøles i romtemperatur før du fortsetter (30-60 min). Vask lysbildene 3 x 1 min med dobbeltdestillert vann.
- Dypp glir i vaskebuffer arbeidsløsning i 2 min. Utfør neste antistoffinkubasjon.
- Neste antistoff inkubasjon
- Gjenta trinn 3.2-3.8 (unntatt trinn 3.7).
- Cellekjernefarging og vevsforsegling
- Dekk vevsseksjonene med DAPI-arbeidsløsningen og inkuber lysbildene i et fuktet kammer i 5 minutter ved romtemperatur. Vask lysbildene i 3 x 2 min med dobbeltdestillert vann.
- Fjern vanndråper fra lysbildene, tilsett 10-20 μL antifluorescensslukker til hvert lysbilde, og forsegl lysbildene med et mikroskopdekselglass.
- Oppbevar de ferdige lysbildene ved 4 °C, beskyttet mot lys, i mer enn 1 måned.
MERK: Pass på å unngå luftbobler.
4. Sett opp den negative kontrollen
- Behandle de negative kontrollglidene som de vevholdige lysbildene, men uten tilsetning av reagenser som primære antistoffer, sekundære antistoffer, TSA-reagenser og DAPI, som brukes til å fjerne vevsautofluorescens ved skanning av filmen.
5. Helautomatisk skanning av vevsglass
MERK: Utstyret som brukes til spektral avbildning er en helautomatisk multispektral vevskvantifiseringsanalysator, og avbildning og analysevisualisering av 5-fargede lysbilder kan utføres ved hjelp av det refererte systemet (se materialfortegnelse). Systemet bruker multispektral avbildning for kvantitativ blanding av flere fluoroforer og vevsautofluorescens.
- Still inn eksponeringstid og skanneprogram manuelt for hver fluorescenskanal og bekreft at instrumentet har fullført helautomatisk eksponering og skanning av vevslysbildene.
MERK: Glideflaten må være ren og fri for vannfilm. Vær forsiktig med mengden forsegler: for mye vil føre til at dekselet glir og instrumentet rapporterer en feil.
6. Analyse av fluorescens
- Dobbeltklikk på programvaren (se materialfortegnelsen), dra den flerfargede fluorescensbildefilen hentet fra den opprinnelige skanningen inn i programvaren, og sett bildetypen til fluorescens.
- Klikk på Lysstyrke & kontrast-knappen og sjekk kanalene på panelet. Klikk utenfor og deretter på kanalen for å velge fluorescenskanalen av interesse. Dra Min-skjermen og Maks-skjermen for å justere lysstyrken og kontrasten for hver kanal.
- Etter analyse, bestem visningen som skal lagres, klikk på Vis lysbildeoversikt og Vis markørplassering for å fjerne disse to innholdet, hold skalalinjen og klikk Fil | Eksporter øyeblikksbilde | Gjeldende visningsprogram for å eksportere en png-fil.
MERK: Hver fluorescenskanal og en sammenslått figur må eksporteres for fremtidig analyse. - For ytterligere analyse av målcellepositivitet, bruk programvare for celleidentifikasjon og segmentering21 (se Materialliste).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi optimaliserte matchingsskjemaet for CD8 primære antistoffer og fluoroforer. Begge sett med fluorescensresultater korresponderte med nøyaktig de samme antistoffinkubasjonsbetingelsene i eksperimentgruppen, bortsett fra endringen i antistoffmatchet fluorofor. Som vist i figur 2 var det en signifikant forskjell i kanalmatchingen av CD8+ T-celler med fluorofor 480 og fluorofor 690. Kanalen med fluorofor 690 viser en ekstremt sterk fluorescerende bakgrunn - det store området med rød uregelmessig fluorescens i den gule sirkelen viser farge, noe som forårsaker stor forstyrrelse i lokaliseringsanalysen av CD8 + T-celler (figur 2C, D). Imidlertid viser kanalen med fluorofor 480 en veldig spesifikk CD8-cellemembranpositivitet og ingen fluorescerende bakgrunn. Dermed viser de gule sirklene en veldig tydelig positiv cellemembran (figur 2A), som fullt ut illustrerer viktigheten av antistoff- og fluorescenskanalmatching i denne protokollen.
Fordelingen av makrofager og cytotoksiske T-celler ble undersøkt i ikke-småcellet lungeplateepitelkarsinomvev, og ekspresjonen av det karakteristiske proteinet HMGCS1 i tumorceller og immunceller ble verifisert. Som vist i figur 3 ble bildene hentet fra QuPath 0.3.2. mIHC-panelet var fluoroforer 480, 520, 620, 690 og DAPI, og de tilsvarende antistoffmarkørene var CK5/6, en markør for lungeplateepitelkarsinomceller; CD8, en markør for T-celler; CD68, en markør for makrofager; og HMGCS1, som er spesifikk for plasma-positive tumorceller. Makrofager og CD8+ T-celler viste kraftig infiltrasjon og ble distribuert rundt og innenfor plateepitelkarsinomfoci, mens HMGCS1 ble mye uttrykt i plateepitelcelleplasmaet, som viste sterk tumorcellepositivitet.
Figur 1 Arbeidsflyt for multiplex immunhistokjemisk farging for FFPE-vev. Forkortelse: FFPE = formalinfast og parafin-innebygd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Optimalisering av matchingsprotokollene for CD8 og fluoroforer. Det var en signifikant forskjell i kanaltilpasningen av CD8+ T-celler med fluorofor 480 og fluorofor 690. Skalastenger = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Multiplekset immunhistokjemisk farging ved lungeplateepitelkarsinom. Fordelingen av makrofager og cytotoksiske T-celler i ikke-småcellet lungeplateepitelkarsinomvev og ekspresjonen av det karakteristiske proteinet HMGCS1 i tumorceller og immunceller. CK5/6 er en markør for lungeplateepitelkarsinomceller; CD8 er en markør for T-celler; CD68 er en markør for makrofager; og HMGCS1 er spesifikk for tumorcelleplasma-positive celler. Skalastenger = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Multiplex immunhistokjemi teknikk | Tradisjonell immunfluorescensteknikk | ||||
| Antall molekylære mål | Ubegrenset (opptil 9 typer farging samtidig, inkludert DAPI) | Generell merking 3-4 typer (inkludert DAPI) | |||
| Image Oppkjøp | Høy fargeoppløsning og fargespesifisitet, signalforsterkning, sterk signalintensitet, lengre slukketid, ingen bakgrunnseffekt og mye høyere signal-støy-forhold på hvert målsted. | Svak lysstyrke, lett slukking, gjensidig påvirkning mellom ulike antistoffer, høy bakgrunn | |||
| Dataanalyse | Arealspesifisitet, cellesegmentering, encelle romlig informasjon | Observasjon av det blotte øye og nøyaktig kvantifisering av ImageJ | |||
Tabell 1: Sammenligning mellom Opal multi-labeling immunfluorescensteknologi og tradisjonell immunfluorescensteknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mIHC er en uunnværlig eksperimentell teknikk innen vitenskapelig forskning for kvantitativ og romlig analyse av flere proteinmarkører på enkeltcellenivå i en enkelt vevsseksjon, og gir intuitive og nøyaktige data for studiet av sykdomspatologi ved å fokusere på detaljert vevstruktur og cellulære interaksjoner i sammenheng med det opprinnelige vevet. Den utbredte adopsjonen av mIHC-teknologi vil kreve optimaliserte og effektive eksperimentelle protokoller. For å løse problemene som kan oppstå i forsøkene, presenterer vi følgende betraktninger og løsninger.
For det første, i henhold til prinsippet om å matche antigen og fluoresceinmerket antistoff i flerfargeeksperimenter, matches svakt uttrykt antigen med sterkt fluoresceinmerket antistoff, og sterkt uttrykt antigen matches med svakt fluoresceinmerket antistoff. Kombinert med resultatene av IHC-eksperimenter av enkeltantistoffmerkede antigener, bestemmes intensiteten av ekspresjonen av målproteinet, og matchingen av antistoff og fluorescein justeres, og bestemmer til slutt matchingsskjemaet for antistoff og fluorescein som kreves i flerfargede merkingseksperimenter. Tilstøtende fluorescenskanaler med forskjellige proteinuttrykksnivåer av antistoffet kan løse problemet med tilstøtende fluorescenskanalstrengfarge. For det andre ble programvareinnstillingene for deteksjon av fluorescenssignaler satt ved hjelp av Akoya Biosciences bildebehandlingssystem for avbildning av fargede lysbilder, og fluorescensoppkjøpsparametrene ble satt ved hjelp av den multispektrale skanningsprogramvaren Phenochart 1.0, som gjør det mulig å kontrollere fluorescenssignalbalansen22. Det anbefales at eksponeringstiden er innenfor 100 ms for en enkelt fluorescenskanal og bør være mer homogen og ikke høyere enn 200 ms for flere fluorescenskanaler. Fluorescensparametrene justeres basert på IHC-optimaliserte antistoffinkubasjonsbetingelser.
For det tredje kan problemet med autofluorescens analyseres ved å sette en tom kontroll, kombinert med den karakteristiske spektrale deteksjonen av multispektral avbildning. Dette kan identifisere de blandede fargesignalene og, for formalinfaste parafin-innebygde prøver, forbedre signal-støy-forholdet mellom bildene med omtrent en størrelsesorden ved å fjerne vevsautofluorescens23. For det fjerde, for å adressere vev-ikke-spesifikk kromogenisitet, bør antistoffer med dårlig vevsspesifisitet brukes med animalsk ikke-immun serum som en blokkerende løsning, vanligvis tilsatt før det primære antistoffet. De utvalgte serumartene er generelt de samme som kilden til de sekundære antistoffartene, noe som kan redusere uspesifikk kromogenisitet. For det femte anbefales det å sette opp negativ kontroll og positive kontroller som eksperimentelle kvalitetskontroller. Den positive kontrollen har rollen som å kontrollere kvaliteten på reagenser, og den negative kontrollen har den dobbelte funksjonen til å verifisere kvaliteten på eksperimentelle prosedyrer og fjerne autofluorescens ved skanning av lysbilder. Kombinasjonen kan brukes til å sikre nøyaktigheten av hvert eksperiment. For det sjette er lysbildevaskingstrinnet veldig viktig gjennom hele eksperimentet. Reagensene som er tilberedt i protokollen skal brukes, og vasketiden skal brukes til å vaske reagensene av lysbildene ved hvert trinn for å forhindre interferens med merkingen i neste trinn.
Når spesifisiteten til en enkelt fluorescenskanal er dårlig, noe som resulterer i uspesifikk positivitet og fluorescens krysstale, må brukerne sjekke IHC-resultatet av det aktuelle antistoffet, bekrefte det positive resultatet og deretter vurdere å endre den aktuelle fluoroforen. Hvis et enkelt positivt fluorescensresultat er for svakt eller for sterkt, er det viktig å tilbakestille filmskanningsparametrene til den anbefalte fluoroforeksponeringstiden på 10-150 ms.
Denne metoden for flere merking er for tiden begrenset til paraffin-innebygde vevsprøver, da proteinmerkingsprosessen krever flere antigene termiske reparasjoner, som krever at vevet skal festes for å forhindre brudd. Frosne seksjoner av ferskt vev vil ikke tåle skader forårsaket av termisk reparasjon, og store mengder vev vil gå tapt.
Oppsummert er denne multippel antigen in situ-merkingsmetoden mindre tidkrevende, med en enkelt antistoffmerkingsprosesstid på mindre enn 3 timer. Den kombinerer fordelene med et multispektralt bildebehandlingssystem og profesjonell patologianalyseprogramvare for å optimalisere mIHC-eksperimentell protokoll når det gjelder individuelle proteinmerkingsforhold og eksperimentelle gruppe- og fluorescenskanalinnstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne medlemmer av Clinical Pathology Research Institute West China Hospital, som bidro med teknisk veiledning for kvalitet multiplex immunfluorescens og IHC-behandling. Denne protokollen ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82200078).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-CD8 | Abcam | ab237709 | Primary antibody, 1/100, PH9 |
| Anti-CD68 | Abcam | ab955 | Primary antibody, 1/300, PH9 |
| Anti-CK5/6 | Millipore | MAB1620 | Primary antibody, 1/150, PH9 |
| Anti-HMGCS1 | GeneTex | GTX112346 | Primary antibody, 1/300, PH6 |
| Animal nonimmune serum | MXB Biotechnologies | SP KIT-B3 | Antigen blocking |
| Fluormount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Anti-fluorescent burst |
| Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit | Akoya | NEL861001KT | Opal mIHC Staining |
| Wash Buffer | Dako | K8000/K8002/K8007/K8023 | Washing the tissues slides |
| Software | |||
| HALO | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| inForm | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| PerkinElmer Vectra | multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides. | ||
| QuPath 0.3.2 | intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment. |
References
- Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).
- Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).
- Nghiem, P. T., et al. PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).
- Zaretsky, J. M., et al. Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma. The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).
- Wang, C., et al. The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289 (2022).
- Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count. Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).
- Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development. Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Meany, D. L., Hackler, L. Jr, Zhang, H., Chan, D. W. Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).
- Surace, M., et al. Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390 (2019).
- Lazarus, J., et al. Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915 (2019).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Mansfield, J. R. Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated QUantitative Analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. QuPath: The global impact of an open source digital pathology system. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 852-859 (2021).
- Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 16878 (2017).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System. Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).
- Wilson, C. M., et al. Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data. Cancers. 13 (12), 3031 (2021).
- Mori, H., et al. Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).
- Mansfield, J. R. Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets. Methods. 52 (4), 271-280 (2010).
