Summary
Данный экспериментальный протокол описывает и оптимизирует метод мультиплексного иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания, в основном за счет оптимизации условий инкубации одноканальных антител и корректировки настроек антител и каналов для решения проблем аутофлуоресценции и перекрестных помех каналов в тканях рака легкого клинического происхождения.
Abstract
Рак легких является ведущей причиной заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей во всем мире, а сложное опухолевое микроокружение считается основной причиной смерти пациентов с раком легких. Сложность опухолевого микроокружения требует эффективных методов для понимания межклеточных взаимоотношений в опухолевых тканях. Метод мультиплексной иммуногистохимии (mIHC) стал ключевым инструментом для выяснения взаимосвязи между экспрессией белков выше и ниже сигнальных путей в опухолевых тканях и разработки клинических диагнозов и планов лечения. mIHC — это метод иммунофлуоресцентного окрашивания с несколькими метками, основанный на технологии усиления сигнала тирамина (TSA), который может одновременно обнаруживать несколько молекул-мишеней на одном и том же образце среза ткани для достижения различной коэкспрессии белка и анализа колокализации. В данном экспериментальном протоколе залитые парафином срезы тканей плоскоклеточной карциномы легкого клинического генеза подвергали мультиплексному иммуногистохимическому окрашиванию. Оптимизировав протокол эксперимента, удалось добиться мультиплексного иммуногистохимического окрашивания меченых клеток-мишеней и белков, решив проблему аутофлуоресценции и перекрестных помех каналов в легочных тканях. Кроме того, мультиплексное иммуногистохимическое окрашивание широко используется для экспериментальной валидации высокопроизводительного секвенирования, связанного с опухолью, включая секвенирование отдельных клеток, протеомику и секвенирование тканевого пространства, обеспечивая интуитивно понятные и визуальные результаты валидации патологии.
Introduction
Тираминовая амплификация сигнала (TSA), которая имеет более чем 20-летнюю историю, представляет собой класс методов анализа, в которых используется пероксидаза хрена (HRP) для мечения целевых антигенов in situ высокой плотности и широко применяется в иммуноферментных анализах (ИФА), гибридизации in situ (ISH), иммуногистохимии (IHC) и других методах обнаружения биологических антигенов. существенное повышение чувствительности детектируемого сигнала1. Опаловое полихроматическое окрашивание по технологии TSA было разработано недавно и широко используется в нескольких исследованиях 2,3,4,5. Традиционное иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание предоставляет исследователям простой инструмент для обнаружения и сравнения распределения белков в клетках и тканях различных модельных организмов. Он основан на связывании антитело/антиген-специфического и включает в себя прямой и косвенный подходы6. Прямое иммуноокрашивание предполагает использование флуорофор-конъюгированного первичного антитела против интересующего антигена, что позволяет проводить прямое флуоресцентное обнаружение с помощью флуоресцентного микроскопа. Подход непрямого иммуноокрашивания заключается в применении флуорофор-конъюгированного вторичного антитела против неконъюгированного первичного антитела 6,7.
Традиционные, однометочные, иммунофлуоресцентные методы окрашивания могут окрашивать только один, два или, в некоторых случаях, три антигена в тканях, что является основным ограничением в извлечении богатой информации, содержащейся в срезах тканей. Интерпретация количественных результатов часто зависит от визуального наблюдения и точной количественной оценки с помощью программного обеспечения для визуализации, такого как ImageJ. Существуют технические ограничения, такие как ограничение видов антител, слабые сигналы флуоресцентных меток и наложение цветов флуоресцентных красителей (табл. 1). Методика Opal multiplex IHC (mIHC) основана на производной TSA, которая позволяет проводить мультиплексное окрашивание и дифференциальное мечение более 7-9 антигенов на одном участке ткани, без ограничения происхождения первичного антитела, но требует высокой специфичности соответствующего антитела к антигену. Процедура окрашивания аналогична обычному иммунофлуоресцентному окрашиванию, за исключением двух отличий: каждый раунд окрашивания включает в себя использование только одного антитела и добавляется этап элюирования антител. Антитела, связанные с антигеном нековалентными связями, могут быть удалены микроволновым элюированием, но флуоресцентный сигнал TSA, связанный с поверхностью антигена ковалентными связями, сохраняется.
Активированные молекулы тирамина (Т), меченные красителем, высоко обогащены антигеном-мишенью, что позволяет эффективно усиливать флуоресцентный сигнал. Это позволяет напрямую маркировать антиген без интерференции антител, а затем многоцветное мечение может быть достигнуто после нескольких циклов окрашивания 8,9,10 (рис. 1). Несмотря на то, что эта технология позволяет получать надежные и точные изображения для изучения заболеваний, создание полезной мультиплексной стратегии флуоресцентного иммуногистохимического окрашивания (mfIHC) может быть трудоемким и точным из-за необходимости обширной оптимизации и проектирования. Таким образом, этот протокол мультиплексной панели был оптимизирован в автоматизированной окрашивателе IHC с более коротким временем окрашивания, чем у ручного протокола. Этот подход может быть непосредственно применен и адаптирован любым исследователем для иммуноонкологических исследований образцов тканей, зафиксированных формалином и залитых парафином (FFPE) тканей человека11. Кроме того, методы подготовки предметных стекол, оптимизации антител и мультиплексного дизайна будут полезны для получения надежных изображений, представляющих точные клеточные взаимодействия in situ, и для сокращения периода оптимизации для ручного анализа12.
mfIHC в основном включает в себя получение изображений и анализ данных. С точки зрения получения изображений, многоцветные меченые сложные образцы должны быть обнаружены с помощью профессионального оборудования спектральной визуализации для идентификации различных смешанных цветовых сигналов и получения изображений с высоким соотношением сигнал/шум без помех от тканевой автофлуоресценции. Современное оборудование для спектральной визуализации в основном включает в себя спектральные конфокальные микроскопы и мультиспектральные системы визуализации тканей. Мультиспектральная система визуализации тканей представляет собой профессиональную систему визуализации, предназначенную для количественного анализа срезов тканей, и ее важнейшей особенностью является получение спектральной информации изображения, которая обеспечивает как морфологическую структуру, так и информацию об оптическом картировании образцов биологических тканей13,14. Любой пиксель в спектральном изображении содержит полную спектральную кривую, и каждый краситель (включая автофлуоресценцию) имеет свой соответствующий характеристический спектр, что позволяет полностью регистрировать и точно идентифицировать смешанные и перекрывающиеся многометочные сигналы.
С точки зрения анализа данных, многоцветные меченые образцы чрезвычайно сложны из-за морфологической структуры и составляющих клеток образцов тканей. Обычное программное обеспечение не может автоматически идентифицировать различные типы тканей. Таким образом, интеллектуальное программное обеспечение для количественного анализа экспрессии антигена в определенных областях 15,16,17,18 используется интеллектуальное программное обеспечение для количественного анализа тканей.
Прежде всего, многометчатое иммунофлуоресцентное окрашивание в сочетании с мультиспектральной визуализацией и технологией количественного анализа патологии обладает такими преимуществами, как большое количество мишеней для обнаружения, эффективное окрашивание и точный анализ, и, следовательно, оно может значительно повысить точность гистоморфологического анализа, выявить пространственные отношения между белками с разрешением на клеточном уровне и помочь извлечь более богатую и надежную информацию из образцов срезов тканей19 (Таблица 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол утвержден руководящими принципами Комитета по этике Западно-Китайского госпиталя Сычуаньского университета, Китай. Образцы ткани рака легких были получены во время операции в Центре рака легких Западно-Китайского госпиталя, и от каждого пациента было получено информированное согласие.
1. Подготовка тканевого среза
- Подготовка к FFPE
- Погрузить клинические ткани в нейтральный раствор формалина более чем на 72 ч.
- Завершают процесс обезвоживания тканей с помощью ксилола и градуированных спиртовых растворов20.
- Выполняйте ручное заделывание парафина и секционирование тканей при толщине секции 4 мкм. Используйте предметные стекла адгезионного микроскопа, чтобы убедиться, что срезы ткани не выпадают.
- Выпекайте предметные стекла в духовке при температуре 65 °C в течение 2 часов, чтобы ткань и предметные стекла высохли. Хранить в коробке для слайдов при комнатной температуре.
- Предварительная обработка срезов тканей
- Предварительно обработайте предметные стекла ткани в духовке при температуре 65 °C в течение 5 мин, а затем последовательно погрузите в растворы ксилола на 2 x 15 мин, безводные растворы этанола на 2 x 15 мин, 90% раствор этанола на 10 мин, 85% раствор этанола на 10 мин, 80% раствор этанола на 10 мин и 75% раствор этанола на 10 мин, Затем промывание предметных стекол стерилизованной водой в течение 3 х 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот экспериментальный метод может быть использован только для тканей FFPE, а не для замороженных или свежих тканей, так как процесс репарации множественными высокотемпературными антигенами приводит к тому, что ткань отпадает от предметного стекла.
- Предварительно обработайте предметные стекла ткани в духовке при температуре 65 °C в течение 5 мин, а затем последовательно погрузите в растворы ксилола на 2 x 15 мин, безводные растворы этанола на 2 x 15 мин, 90% раствор этанола на 10 мин, 85% раствор этанола на 10 мин, 80% раствор этанола на 10 мин и 75% раствор этанола на 10 мин, Затем промывание предметных стекол стерилизованной водой в течение 3 х 1 мин.
2. Оптимизация первичных антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения условий инкубации отдельных антител, в основном включая концентрацию антител и условия репарации антигенов, использовались обычные эксперименты с ИГХ. Обратитесь к условиям, приведенным в инструкции по применению антител.
- Используйте концентрацию антител немного выше рекомендуемого диапазона концентраций и промежуточных значений.
- Оптимизируйте процедуры извлечения антигенного буфера PH6 и PH9 в соответствии с локализацией экспрессии белка. Используйте PH9 для белков, экспрессируемых в ядре, и используйте рутину (PH6 или PH9) для других белков.
3. Метод окрашивания mIHC
ПРИМЕЧАНИЕ: Опаловое окрашивание mIHC является одним из доступных методов mIHC. В этом экспериментальном 5-цветном протоколе, поскольку каждый образец ткани должен быть окрашен четырьмя антителами, необходимы четыре инкубации первичных антител, инкубация вторичных антител и хромогенная инкубация с амплификацией сигнала TSA, а также пять реставраций антигенов. Наконец, выполняется окрашивание 4'6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и герметизация антифлуоресцентным разрывным агентом.
- Приготовление основных реагентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Определите количество добавляемого реагента в соответствии с размером тканевых предметных стекол. Используйте достаточный объем, чтобы полностью покрыть участок ткани (как правило, 50-150 мкл на предметное стекло). Рабочие растворы, необходимые для эксперимента, готовят следующим образом:- Рабочий раствор буфера для промывки: разбавьте буфер для промывки в 20 раз в соотношении 1:20 водой двойной дистилляции и храните при комнатной температуре.
- Буферный рабочий раствор PH6: Разбавьте буфер PH6 в соотношении 1:100 двойной дистиллированной водой. Перед употреблением подготовить и хранить при комнатной температуре.
- Буферный рабочий раствор PH9: Разбавьте 50x буфер PH9 в соотношении 1:50 двойной дистиллированной водой. Перед употреблением подготовить и хранить при комнатной температуре.
- Полимерный HRP: Готовьте этот готовый к применению раствор только для первичных антител кролика и мышиного происхождения.
- Рабочий раствор флуорофора: Восстановите каждый порошок флуорофора (кроме флуорофора 780) в 75 мкл ДМСО. Перед каждой процедурой разбавляйте флуорофор в 1-кратном амплификационном разбавителе в соотношении 1:100. Выбросьте неиспользованную часть рабочего раствора флуорофора.
- Рабочий раствор флуорофора 780: Восстановите TSA-DIG в 75 мкл ДМСО и порошок флуорофора 780 в 300 мкл воды двойной дистиллированной воды. Перед процедурой разбавьте TSA-DIG в 1х амплификационном разбавителе в соотношении 1:100 и разбавьте флуорофор 780 разбавителем Ab в соотношении 1:25.
- Рабочий раствор DAPI: Разбавьте раствор DAPI в соотношении 1:50 водой двойной дистилляции или PBS. Перед употреблением подготовить и хранить при температуре 4 °C не более 48 ч.
ЗАМЕТКА. Мойте предметные стекла только двойной дистиллированной водой и свежеприготовленным рабочим раствором буфера для промывки на протяжении всего эксперимента по флуоресцентному окрашиванию с несколькими этикетками. Срезы тканей не должны соприкасаться с водопроводной водой; Загрязняющие вещества в водопроводной воде могут прилипать к срезам тканей и вызывать автофлуоресценцию. Держите образцы вдали от света на протяжении всего эксперимента.
- Извлечение антигена
- Поместите предметные стекла в коробку для окрашивания и ремонта, заполните ее буферным рабочим раствором PH6 или PH9, накройте крышкой и нагревайте в микроволновой печи в течение 2 x 8 минут при 100% мощности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте двойную дистиллированную воду в ремонтную коробку во время процесса нагрева, чтобы предотвратить чрезмерное испарение, которое может привести к высыханию ломтиков. - Дайте предметным стеклам остыть при комнатной температуре, прежде чем продолжить (30-60 минут).
- Промойте горки 3 x 2 мин водой двойной дистиллированной воды. Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы обхватить участок ткани на предметном стекле.
- Поместите предметные стекла в коробку для окрашивания и ремонта, заполните ее буферным рабочим раствором PH6 или PH9, накройте крышкой и нагревайте в микроволновой печи в течение 2 x 8 минут при 100% мощности.
- Блокировка
- Срезы тканей погрузить в промывочный буфер, покрыть блокирующим раствором и инкубировать предметные стекла в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Инкубация первичных антител
- Удалите блокирующий раствор с предметных стекол и покройте участки тканей рабочим раствором первичных антител. Инкубируют предметные стекла в увлажненной камере в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе или в течение ночи при 4 °C в холодильнике.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания слайдов.
- Удалите блокирующий раствор с предметных стекол и покройте участки тканей рабочим раствором первичных антител. Инкубируют предметные стекла в увлажненной камере в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе или в течение ночи при 4 °C в холодильнике.
- Внедрение полимерного HRP
- Промыть предметные стекла в рабочем растворе промывочного буфера в течение 3 х 2 мин. Добавьте полимер HRP непосредственно по каплям на срезы ткани и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предметных стекол, хранящихся в холодильнике, держите их при комнатной температуре примерно 30 минут перед стиркой, чтобы удалить первичные антитела.
- Промыть предметные стекла в рабочем растворе промывочного буфера в течение 3 х 2 мин. Добавьте полимер HRP непосредственно по каплям на срезы ткани и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Генерация усиления сигнала тирамина (TSA)
- Промыть предметное стекло рабочим раствором промывочного буфера в течение 3 х 2 мин, добавить рабочий раствор флуорофора непосредственно по каплям в срезы ткани и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть предметное стекло рабочим раствором промывочного буфера в течение 3 х 2 мин.
- Специальная процедура для флуорофора 780
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуорофор 780 является слабым и обычно занимает последнее место в схеме подбора цветов во всем эксперименте. Флуорофор 780 обычно не используется в этом экспериментальном протоколе, но из-за его специфичности его экспериментальные этапы перечислены.- Внедрение TSA-DIG
- Промыть предметное стекло рабочим раствором промывочного буфера в течение 3 х 2 мин, добавить рабочий раствор TSA-Drg по каплям в срезы тканей и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Микроволновая обработка
- Промыть предметные стекла рабочим раствором промывочного буфера в течение 3 х 2 мин.
- Поместите предметные стекла в коробку для окрашивания и ремонта, наполните ее ремонтным раствором, накройте крышкой и нагрейте в микроволновой печи в течение 2 x 8 минут при 100% мощности. Дайте предметным стеклам остыть при комнатной температуре, прежде чем продолжить (30-60 минут).
- Промойте предметные стекла в течение 3 x 2 мин водой двойной дистиллированной воды.
- Генерация сигналов флуорофора 780
- Срезы погружают в промывочный буфер, покрывают рабочим раствором флуорофора 780 и выдерживают предметные стекла в увлажненной камере в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промыть предметные стекла рабочим раствором промывочного буфера в течение 3 х 2 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ выполняйте микроволновую обработку после этого шага.
- Используйте флуорофор 780 в качестве последнего шага всего рабочего процесса, а затем окрашивайте ядра непосредственно рабочим раствором DAPI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите шаг 3.7, если не используете флуорофор 780.
- Внедрение TSA-DIG
- Микроволновая обработка
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта микроволновая стадия удаляет первичный-вторичный комплекс HRP и повторно экспонирует антигены, позволяя ввести следующее первичное антитело.- Поместите предметные стекла в коробку для окрашивания и ремонта, наполните ее буферным рабочим раствором PH6 или PH9, накройте крышкой и нагревайте в микроволновой печи в течение 2 x 8 минут при 100% мощности.
- Дайте предметным стеклам остыть при комнатной температуре, прежде чем продолжить (30-60 минут). Промыть предметные стекла 3 х 1 мин двойной дистиллированной водой.
- Окуните предметные стекла в рабочий раствор промывочного буфера на 2 мин. Выполните следующую инкубацию антител.
- Следующая инкубация антител
- Повторите шаги 3.2-3.8 (кроме шага 3.7).
- Ядерное окрашивание клеток и герметизация тканей
- Срезы тканей покрыть рабочим раствором DAPI и инкубировать предметные стекла в увлажненной камере в течение 5 мин при комнатной температуре. Промойте предметные стекла в течение 3 x 2 мин водой двойной дистиллированной воды.
- Удалите капли воды со предметных стекол, добавьте 10-20 мкл антифлуоресцентного гасителя на каждый предметный стеклянный предметный стекла и запечатайте предметные стекла покровным стеклом микроскопа.
- Готовые слайды хранить при температуре 4 °C, в защищенном от света месте, более 1 месяца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не было пузырьков воздуха.
4. Настройте отрицательный контроль
- Обрабатывайте отрицательные контрольные слайды так же, как и тканевые слайды, но без добавления реагентов, таких как первичные антитела, вторичные антитела, реагенты TSA и DAPI, которые используются для удаления тканевой автофлуоресценции при сканировании пленки.
5. Полностью автоматическое сканирование предметных стекол тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование, используемое для спектральной визуализации, представляет собой полностью автоматизированный мультиспектральный анализатор количественного определения тканей, а визуализация и анализ визуализации и анализа 5-цветных слайдов может быть выполнена с использованием эталонной системы (см. таблицу материалов). Система использует мультиспектральную визуализацию для количественного смешивания нескольких флуорофоров и тканевой автофлуоресценции.
- Вручную установите время экспозиции и программу сканирования для каждого флуоресцентного канала и убедитесь, что прибор выполнил полностью автоматическую экспозицию и сканирование предметных стекол ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность предметного стекла должна быть чистой и очищенной от водяной пленки. Будьте осторожны с количеством герметика: слишком большое количество приведет к тому, что покровный лист соскользнет, а инструмент сообщит об ошибке.
6. Анализ флуоресценции
- Дважды щелкните программное обеспечение (см. Таблицу материалов), перетащите файл многоцветного флуоресцентного изображения, полученного из исходного скана, в программное обеспечение и установите тип изображения на флуоресценцию.
- Нажмите кнопку «Яркость и контрастность » и проверьте каналы на панели. Щелкните снаружи, а затем по каналу , чтобы выбрать интересующий канал флуоресценции. Перетащите дисплеи «Мин» и «Максимум », чтобы отрегулировать яркость и контрастность каждого канала.
- После анализа определите вид для сохранения, нажмите Показать обзор слайда и Показать положение курсора , чтобы удалить эти два содержимого, сохраните масштабную линейку и нажмите Файл | Экспорт снимка | Текущее содержимое средства просмотра для экспорта PNG-файла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый флуоресцентный канал и объединенная фигура должны быть экспортированы для последующего анализа. - Для дальнейшего анализа положительного результата клеток-мишеней используйте программное обеспечение для идентификации и сегментации клеток21 (см. таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оптимизирована схема подбора первичных антител CD8 и флуорофоров. Оба набора результатов флуоресценции соответствовали точно таким же условиям инкубации антител в экспериментальной группе, за исключением изменения флуорофора, соответствующего антителам. Как показано на рисунке 2, была выявлена существенная разница в совпадении каналов CD8+ Т-клеток с флуорофором 480 и флуорофором 690. Канал с флуорофором 690 показывает чрезвычайно сильный флуоресцентный фон - большая область красной нерегулярной флуоресценции в пределах желтого круга показывает цвет, что вызывает большие помехи при анализе локализации CD8+ Т-клеток (рис. 2C,D). Тем не менее, канал с флуорофором 480 показывает очень специфическую позитивность клеточной мембраны CD8 и отсутствие флуоресцентного фона. Таким образом, желтые круги показывают очень четкую положительную клеточную мембрану (рис. 2А), что полностью иллюстрирует важность соответствия антител и флуоресцентных каналов в этом протоколе.
Исследовано распределение макрофагов и цитотоксических Т-клеток в тканях немелкоклеточной плоскоклеточной карциномы легкого, верифицирована экспрессия характерного белка HMGCS1 в опухолевых клетках и иммунных клетках. Как показано на рисунке 3, изображения были получены из QuPath 0.3.2. Панель mIHC состояла из флуорофоров 480, 520, 620, 690 и DAPI, а соответствующими маркерами антител были CK5/6, маркер клеток плоскоклеточной карциномы легкого; CD8 – маркер для Т-клеток; CD68 – маркер макрофагов; и HMGCS1, специфичный для плазмопозитивных опухолевых клеток. Макрофаги и CD8+ Т-клетки демонстрировали сильную инфильтрацию и были распределены вокруг и внутри очагов плоскоклеточной карциномы, в то время как HMGCS1 широко экспрессировался в плазме клеток плоскоклеточной карциномы, демонстрируя сильную позитивность опухолевых клеток.
Рисунок 1: Рабочий процесс мультиплексного иммуногистохимического окрашивания ткани FFPE. Аббревиатура: FFPE = формалин-фиксированный и парафинообразный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оптимизация протоколов согласования для CD8 и флуорофоров. Выявлена достоверная разница в совпадении каналов CD8+ Т-клеток с флуорофором 480 и флуорофором 690. Масштабные линейки = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Мультиплексное иммуногистохимическое окрашивание при плоскоклеточной карциноме легкого. Распределение макрофагов и цитотоксических Т-клеток в тканях немелкоклеточной плоскоклеточной карциномы легкого и экспрессия характерного белка HMGCS1 в опухолевых клетках и иммунных клетках. CK5/6 является маркером клеток плоскоклеточной карциномы легкого; CD8 является маркером для Т-клеток; CD68 является маркером макрофагов; и HMGCS1 специфичен для плазмапозитивных клеток опухолевых клеток. Масштабные линейки = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Мультиплексная иммуногистохимическая методика | Традиционная иммунофлюоресцентная методика | ||||
| Количество молекулярных мишеней | Без ограничений (до 9 видов окрашивания одновременно, включая DAPI) | Общая маркировка 3-4 вида (в т.ч. DAPI) | |||
| Получение изображений | Высокое разрешение и специфичность окрашивания, усиление сигналов, высокая интенсивность сигнала, более длительное время тушения, отсутствие фонового эффекта и гораздо более высокое отношение сигнал/шум на каждом целевом участке. | Слабая яркость, легкое тушение, взаимное влияние между различными антителами, высокий фон | |||
| Анализ данных | Специфичность площадей, сегментация ячеек, пространственная информация по одной ячейке | Наблюдение невооруженным глазом и точная количественная оценка с помощью ImageJ | |||
Таблица 1: Сравнение технологии мультимечения иммунофлуоресценции Opal с традиционной технологией иммунофлуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mIHC является незаменимым экспериментальным методом в области научных исследований для количественного и пространственного анализа множественных белковых маркеров на уровне одной клетки в одном срезе ткани, предоставляя интуитивно понятные и точные данные для изучения патологии заболевания путем сосредоточения внимания на детальной структуре ткани и клеточных взаимодействиях в контексте исходной ткани. Широкое внедрение технологии mIHC потребует оптимизированных и эффективных экспериментальных протоколов. Для решения проблем, которые могут возникнуть в ходе экспериментов, мы представляем следующие соображения и решения.
Во-первых, в соответствии с принципом сопоставления антигена и флуоресцеин-меченного антитела в многоцветных экспериментах, слабо экспрессируемый антиген сопоставляется с сильно флуоресцеин-меченым антителом, а сильно экспрессированный антиген — со слабо флуоресцеин-меченым антителом. В сочетании с результатами экспериментов ВПХ с антигенами, меченными одиночными антителами, определяется интенсивность экспрессии белка-мишени и корректируется сопоставление антител и флуоресцеина, что окончательно определяет схему сопоставления антител и флуоресцеина, необходимую в экспериментах по многоцветному мечению. Соседние флуоресцентные каналы с различными уровнями экспрессии белка антитела могут решить проблему цвета нити соседнего флуоресцентного канала. Во-вторых, настройки программного обеспечения для детектирования флуоресцентных сигналов были заданы с помощью системы визуализации Akoya Biosciences для визуализации окрашенных предметных стекол, а параметры регистрации флуоресценции были заданы с помощью программного обеспечения мультиспектрального сканирования Phenochart 1.0, позволяющего проверить баланс флуоресцентного сигнала22. Рекомендуется, чтобы время экспозиции было в пределах 100 мс для одного флуоресцентного канала и должно быть более однородным и не более 200 мс для нескольких флуоресцентных каналов. Параметры флуоресценции корректируются в зависимости от оптимальных условий инкубации антител с помощью ВПХ.
В-третьих, проблема автофлуоресценции может быть проанализирована установкой холостого управления в сочетании с характеристическим спектральным детектированием мультиспектральных изображений. Это позволяет идентифицировать смешанные цветовые сигналы и, для образцов, зафиксированных формалином, с включенным парафином, улучшить отношение сигнал/шум изображений примерно на порядок за счет удаления тканевой автофлуоресценции23. В-четвертых, для решения проблемы тканеспецифической хромогенности антитела с низкой тканевой специфичностью следует использовать с неиммунной сывороткой крови животных в качестве блокирующего раствора, обычно добавляемого перед первичным антителом. Выбранный вид сыворотки, как правило, совпадает с источником вторичных видов антител, что может снижать неспецифическую хромогенность. В-пятых, рекомендуется установить отрицательный и положительный контроль в качестве экспериментального контроля качества. Положительный контроль выполняет роль проверки качества реагентов, а отрицательный контроль выполняет двойную функцию: проверка качества экспериментальных процедур и удаление автофлуоресценции при сканировании предметных стекол. Эта комбинация может быть использована для обеспечения точности каждого эксперимента. В-шестых, этап промывки предметных стекол очень важен на протяжении всего эксперимента. Следует использовать реагенты, приготовленные в протоколе, а время промывки следует использовать для смывания реагентов с предметных стекол на каждом этапе, чтобы предотвратить вмешательство в маркировку на следующем этапе.
Когда специфичность одного флуоресцентного канала низкая, что приводит к неспецифической положительности и перекрестным помехам флуоресценции, пользователи должны проверить результат ИГХ соответствующего антитела, подтвердить положительный результат, а затем рассмотреть возможность замены соответствующего флуорофора. Если один положительный результат флуоресценции слишком слабый или слишком сильный, важно сбросить параметры сканирования пленки до рекомендуемого времени экспозиции флуорофора 10-150 мс.
Этот метод множественного мечения в настоящее время ограничен образцами тканей, залитых парафином, поскольку процесс мечения белков требует многократной антигенной термической репарации, которая требует фиксации ткани для предотвращения разрушения. Замороженные участки свежей ткани не выдержат повреждений, вызванных термическим восстановлением, и большое количество ткани будет потеряно.
Таким образом, этот метод мечения множественными антигенами in situ является менее трудоемким, поскольку время процесса мечения одного антитела составляет менее 3 часов. Он сочетает в себе преимущества мультиспектральной системы визуализации и профессионального программного обеспечения для анализа патологий для оптимизации экспериментального протокола mIHC с точки зрения индивидуальных условий мечения белков и настроек экспериментальной группы и флуоресцентного канала.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы выражают признательность сотрудникам Научно-исследовательского института клинической патологии Западно-Китайского госпиталя, которые внесли свой вклад в техническое руководство по качественной мультиплексной иммунофлуоресценции и процессингу ИГХ. Этот протокол был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (82200078).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-CD8 | Abcam | ab237709 | Primary antibody, 1/100, PH9 |
| Anti-CD68 | Abcam | ab955 | Primary antibody, 1/300, PH9 |
| Anti-CK5/6 | Millipore | MAB1620 | Primary antibody, 1/150, PH9 |
| Anti-HMGCS1 | GeneTex | GTX112346 | Primary antibody, 1/300, PH6 |
| Animal nonimmune serum | MXB Biotechnologies | SP KIT-B3 | Antigen blocking |
| Fluormount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Anti-fluorescent burst |
| Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit | Akoya | NEL861001KT | Opal mIHC Staining |
| Wash Buffer | Dako | K8000/K8002/K8007/K8023 | Washing the tissues slides |
| Software | |||
| HALO | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| inForm | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| PerkinElmer Vectra | multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides. | ||
| QuPath 0.3.2 | intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment. |
References
- Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).
- Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).
- Nghiem, P. T., et al. PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).
- Zaretsky, J. M., et al. Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma. The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).
- Wang, C., et al. The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289 (2022).
- Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count. Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).
- Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development. Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Meany, D. L., Hackler, L. Jr, Zhang, H., Chan, D. W. Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).
- Surace, M., et al. Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390 (2019).
- Lazarus, J., et al. Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915 (2019).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Mansfield, J. R. Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated QUantitative Analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. QuPath: The global impact of an open source digital pathology system. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 852-859 (2021).
- Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 16878 (2017).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System. Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).
- Wilson, C. M., et al. Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data. Cancers. 13 (12), 3031 (2021).
- Mori, H., et al. Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).
- Mansfield, J. R. Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets. Methods. 52 (4), 271-280 (2010).
