Summary
Dieses experimentelle Protokoll beschreibt und optimiert eine Multiplex-Immunhistochemie (IHC)-Färbemethode, hauptsächlich durch die Optimierung der Inkubationsbedingungen von Einzelkanal-Antikörpern und die Anpassung der Einstellungen von Antikörpern und Kanälen, um die Probleme der Autofluoreszenz und des Kanalwechsels in Lungenkrebsgeweben klinischen Ursprungs zu lösen.
Abstract
Lungenkrebs ist weltweit die Hauptursache für bösartige tumorbedingte Morbidität und Mortalität, und die komplexe Tumormikroumgebung gilt als die häufigste Todesursache bei Lungenkrebspatienten. Die Komplexität der Tumormikroumgebung erfordert effektive Methoden, um Zell-Zell-Beziehungen in Tumorgeweben zu verstehen. Die Multiplex-Immunhistochemie (mIHC)-Technik ist zu einem Schlüsselwerkzeug geworden, um die Beziehung zwischen der Expression von Proteinen vor und hinter Signalwegen in Tumorgeweben abzuleiten und klinische Diagnosen und Behandlungspläne zu entwickeln. mIHC ist eine Multi-Label-Immunfluoreszenz-Färbemethode, die auf der Tyramine Signal Amplification (TSA)-Technologie basiert und mehrere Zielmoleküle gleichzeitig auf derselben Gewebeschnittprobe nachweisen kann, um unterschiedliche Protein-Co-Expressions- und Co-Lokalisierungsanalysen zu erreichen. In diesem experimentellen Protokoll wurden paraffineingebettete Gewebeschnitte von Lungenplattenepithelkarzinomen klinischen Ursprungs einer immunhistochemischen Multiplex-Färbung unterzogen. Durch die Optimierung des experimentellen Protokolls wurde eine immunhistochemische Multiplex-Färbung von markierten Zielzellen und Proteinen erreicht, wodurch das Problem der Autofluoreszenz und des Kanalwechsels im Lungengewebe gelöst wurde. Darüber hinaus wird die immunhistochemische Multiplex-Färbung häufig bei der experimentellen Validierung von tumorbezogenen Hochdurchsatzsequenzierungen, einschließlich Einzelzellsequenzierung, Proteomik und Geweberaumsequenzierung, eingesetzt und liefert intuitive und visuelle Validierungsergebnisse für die Pathologie.
Introduction
Die mehr als 20-jährige Tyramin-Signalamplifikation (TSA) ist eine Klasse von Assay-Techniken, die Meerrettichperoxidase (HRP) für die In-situ-Markierung von Zielantigenen mit hoher Dichte verwenden und in enzymgebundenen Immunosorbent-Assays (ELISAs), In-situ-Hybridisierung (ISH), Immunhistochemie (IHC) und anderen Techniken zum Nachweis biologischer Antigene weit verbreitet sind. Erhebliche Verbesserung der Empfindlichkeit des detektierten Signals1. Die polychromatische Opalfärbung auf Basis der TSA-Technologie wurde kürzlich entwickelt und in mehreren Studien weit verbreitet 2,3,4,5. Die traditionelle Immunfluoreszenzfärbung (IF) bietet Forschern ein einfaches Werkzeug zum Nachweis und Vergleich der Verteilung von Proteinen in den Zellen und Geweben verschiedener Modellorganismen. Es basiert auf einer Antikörper-/Antigen-spezifischen Bindung und umfasst direkte und indirekte Ansätze6. Bei der direkten Immunfärbung wird ein Fluorophor-konjugierter Primärantikörper gegen das interessierende Antigen verwendet, was eine direkte Fluoreszenzdetektion mit einem Fluoreszenzmikroskop ermöglicht. Der indirekte Immunfärbeansatz beinhaltet die Anwendung eines Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpers gegen den nicht konjugierten Primärantikörper 6,7.
Herkömmliche Immunfluoreszenz-Färbemethoden können nur ein, zwei oder in einigen Fällen drei Antigene in Geweben färben, was eine große Einschränkung bei der Gewinnung der reichhaltigen Informationen in Gewebeschnitten darstellt. Die Interpretation quantitativer Ergebnisse hängt oft von visueller Beobachtung und genauer Quantifizierung durch Bildgebungssoftware wie ImageJ ab. Es gibt technische Einschränkungen, wie z. B. die Einschränkung der Antikörperspezies, schwache fluoreszierende Markierungssignale und die Farbüberlappung von Fluoreszenzfarbstoffen (Tabelle 1). Die Opal-Multiplex-IHC-Technik (mIHC) basiert auf der TSA-Ableitung, die die Multiplex-Färbung und differentielle Markierung von mehr als 7-9 Antigenen auf demselben Gewebeschnitt ohne Einschränkung der Herkunft des Primärantikörpers ermöglicht, aber eine hohe Spezifität des entsprechenden Antikörpers gegen das Antigen erfordert. Das Färbeverfahren ähnelt dem der normalen Immunfluoreszenzfärbung, mit zwei Unterschieden: Bei jeder Färberunde wird nur ein Antikörper verwendet und ein Antikörper-Elutionsschritt hinzugefügt. Antikörper, die durch nichtkovalente Bindungen an das Antigen gebunden sind, können durch Mikrowellenelution entfernt werden, aber das TSA-Fluoreszenzsignal, das durch kovalente Bindungen an die Oberfläche des Antigens gebunden ist, bleibt erhalten.
Aktivierte Tyramin (T)-Moleküle, die mit dem Farbstoff markiert sind, sind am Zielantigen stark angereichert, was eine effiziente Verstärkung des Fluoreszenzsignals ermöglicht. Dies ermöglicht die direkte Markierung des Antigens ohne Antikörperinterferenz, und dann kann nach mehreren Färbezyklen eine mehrfarbige Markierung erreicht werden 8,9,10 (Abbildung 1). Obwohl diese Technologie zuverlässige und genaue Bilder für die Untersuchung von Krankheiten liefert, kann die Erstellung einer nützlichen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie (mfIHC)-Färbestrategie aufgrund der Notwendigkeit umfangreicher Optimierungen und Designs zeitaufwändig und anspruchsvoll sein. Daher wurde dieses Multiplex-Panel-Protokoll in einem automatisierten IHC-Färbegerät mit einer kürzeren Färbezeit als das manuelle Protokoll optimiert. Dieser Ansatz kann von jedem Forscher für immunonkologische Studien an humanen formalinfixierten und paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeproben direkt angewendet und angepasst werden11. Darüber hinaus werden die Methoden zur Objektträgervorbereitung, Antikörperoptimierung und Multiplex-Design hilfreich sein, um robuste Bilder zu erhalten, die genaue zelluläre Interaktionen in situ darstellen, und um die Optimierungszeit für die manuelle Analyse zu verkürzen12.
Das mfIHC umfasst hauptsächlich die Bilderfassung und Datenanalyse. In Bezug auf die Bildaufnahme müssen mehrfarbig markierte, komplex gefärbte Proben mit professionellen spektralen Bildgebungsgeräten detektiert werden, um die verschiedenen gemischten Farbsignale zu identifizieren und Bilder mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis ohne Störungen durch Gewebeautofluoreszenz zu erhalten. Zu den aktuellen Geräten für die spektrale Bildgebung gehören hauptsächlich spektrale konfokale Mikroskope und multispektrale Gewebebildgebungssysteme. Das multispektrale Gewebebildgebungssystem ist ein professionelles Bildgebungssystem, das für die quantitative Analyse von Gewebeschnitten entwickelt wurde, und sein wichtigstes Merkmal ist die Erfassung von Bildspektralinformationen, die sowohl morphologische Struktur- als auch optische Kartierungsinformationen biologischer Gewebeproben liefern13,14. Jedes Pixel im Spektralbild enthält eine vollständige Spektralkurve, und jeder Farbstoff (einschließlich Autofluoreszenz) hat sein entsprechendes charakteristisches Spektrum, das die vollständige Aufzeichnung und genaue Identifizierung von gemischten und überlappenden Multilabel-Signalen ermöglicht.
In Bezug auf die Datenanalyse sind mehrfarbig markierte Proben aufgrund der morphologischen Struktur und der Bestandteile der Gewebeproben äußerst komplex. Gewöhnliche Software kann verschiedene Gewebetypen nicht automatisch identifizieren. Daher wird eine intelligente quantitative Gewebeanalysesoftware für die quantitative Analyse der Antigenexpression in bestimmten Regionen verwendet 15,16,17,18.
Vor allem hat die Multilabel-Immunfluoreszenzfärbung in Kombination mit multispektraler Bildgebung und quantitativer Pathologie-Analysetechnologie die Vorteile einer großen Anzahl von Nachweiszielen, einer effektiven Färbung und einer genauen Analyse und kann daher die Genauigkeit der histomorphologischen Analyse erheblich verbessern, die räumliche Beziehung zwischen Proteinen mit zellulärer Auflösung aufdecken und dazu beitragen, reichhaltigere und zuverlässigere Informationen aus Gewebeschnittproben zu gewinnen19 (Tabelle 1).
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Protocol
Das Protokoll ist nach den Richtlinien der Ethikkommission des West China Hospital, Sichuan University, China, genehmigt. Die Lungenkrebsgewebeproben wurden während der Operation im Zentrum für Lungenkrebs am West China Hospital entnommen, und von jedem Patienten wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.
1. Vorbereitung des Gewebeschnitts
- FFPE-Vorbereitung
- Tauchen Sie klinisches Gewebe länger als 72 Stunden in neutrale Formalinlösung.
- Schließen Sie den Prozess der Dehydrierung des Gewebes mit Xylol und abgestuften alkoholischen Lösungen20 ab.
- Führen Sie eine manuelle Paraffineinbettung und Gewebeschnitte bei einer Schnittdicke von 4 μm durch. Verwenden Sie Adhäsionsmikroskop-Objektträger, um sicherzustellen, dass die Gewebescheiben nicht herausfallen.
- Die Objektträger im Backofen bei 65 °C 2 h backen, damit das Taschentuch und die Objektträger trocken sind. In einer Objektträgerbox bei Raumtemperatur aufbewahren.
- Vorbehandlung von Gewebeschnitten
- Die Gewebeobjektträger in einem Ofen bei 65 °C für 5 min vorbehandeln und dann nacheinander 2 x 15 min lang in Xylollösungen, 2 x 15 min in wasserfreie Ethanollösungen, 10 min 90%ige Ethanollösung, 10 min 85%ige Ethanollösung, 10 min 80%ige Ethanollösung und 10 min 75%ige Ethanollösung eintauchen. Anschließend werden die Objektträger 3 x 1 min lang mit sterilisiertem Wasser gewaschen.
HINWEIS: Diese experimentelle Technik kann nur für FFPE-Gewebe verwendet werden, nicht für gefrorenes oder frisches Gewebe, da der mehrfache Hochtemperatur-Antigenreparaturprozess dazu führt, dass das Gewebe vom Objektträger fällt.
- Die Gewebeobjektträger in einem Ofen bei 65 °C für 5 min vorbehandeln und dann nacheinander 2 x 15 min lang in Xylollösungen, 2 x 15 min in wasserfreie Ethanollösungen, 10 min 90%ige Ethanollösung, 10 min 85%ige Ethanollösung, 10 min 80%ige Ethanollösung und 10 min 75%ige Ethanollösung eintauchen. Anschließend werden die Objektträger 3 x 1 min lang mit sterilisiertem Wasser gewaschen.
2. Optimierung des Primärantikörpers
HINWEIS: Konventionelle IHC-Experimente wurden verwendet, um die Inkubationsbedingungen für einzelne Antikörper zu bestimmen, hauptsächlich einschließlich Antikörperkonzentration und Antigenreparaturbedingungen. Beachten Sie die Bedingungen in der Bedienungsanleitung für Antikörper.
- Verwenden Sie eine Antikörperkonzentration, die etwas höher ist als der empfohlene Konzentrationsbereich und die empfohlenen Zwischenwerte.
- Optimieren Sie die Antigen-Retrieval-Pufferroutinen PH6 und PH9 entsprechend dem Ort der Proteinexpression. Verwenden Sie PH9 für Proteine, die im Zellkern exprimiert werden, und verwenden Sie entweder Routine (PH6 oder PH9) für andere Proteine.
3. mIHC-Färbemethode
HINWEIS: Die opale mIHC-Färbung ist eine der verfügbaren mIHC-Methoden. Da in diesem experimentellen 5-Farben-Protokoll jede Gewebeprobe mit vier Antikörpern gefärbt werden muss, werden vier primäre Antikörperinkubationen, sekundäre Antikörperinkubationen und TSA-Signalamplifikations-chromogene Inkubationen sowie fünf Antigenrestaurationen benötigt. Schließlich werden eine 4'6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung und eine Anti-Fluoreszenz-Berstmittelversiegelung durchgeführt.
- Vorbereitung des Hauptreagenzes
HINWEIS: Bestimmen Sie die Menge des hinzuzufügenden Reagenzes entsprechend der Größe der Gewebeobjektträger. Verwenden Sie genügend Volumen, um den Gewebeschnitt vollständig zu bedecken (in der Regel 50-150 μl pro Objektträger). Die für das Experiment erforderlichen Arbeitslösungen werden wie folgt hergestellt:- Arbeitslösung für Waschpuffer: 20x Waschpuffer bei 1:20 mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen und bei Raumtemperatur lagern.
- PH6-Puffer-Arbeitslösung: 100x PH6-Puffer bei 1:100 mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Vor Gebrauch vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern.
- PH9-Puffer-Arbeitslösung: 50x PH9-Puffer bei 1:50 mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Vor Gebrauch vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern.
- Polymer HRP: Bereiten Sie diese gebrauchsfertige Lösung nur für Primärantikörper Kaninchen- und Mausursprung vor.
- Fluorophor-Arbeitslösung: Rekonstituieren Sie jedes Fluorophorpulver (außer Fluorophor 780) in 75 μl DMSO. Verdünnen Sie das Fluorophor vor jedem Eingriff in 1x Amplifikationsverdünnungsmittel bei 1:100. Entsorgen Sie alle nicht verwendeten Teile der Fluorophor-Arbeitslösung.
- Fluorophor 780 Arbeitslösung: Rekonstituieren Sie TSA-DIG in 75 μl DMSO und das Fluorophorpulver 780 in 300 μl doppelt destilliertem Wasser. Vor dem Eingriff TSA-DIG in 1x Amplifikationsverdünnungsmittel bei 1:100 und Fluorophor 780 mit Ab-Verdünnungsmittel bei 1:25 verdünnen.
- DAPI-Arbeitslösung: Verdünnen Sie die DAPI-Lösung bei 1:50 mit doppelt destilliertem Wasser oder PBS. Vor Gebrauch vorbereiten und bei 4 °C nicht länger als 48 h lagern.
ANMERKUNG. Waschen Sie die Objektträger während dieses Multilabel-Fluoreszenzfärbeexperiments nur mit doppelt destilliertem Wasser und frisch zubereiteter Waschpuffer-Arbeitslösung. Gewebeschnitte dürfen nicht mit Leitungswasser in Berührung kommen; Verunreinigungen im Leitungswasser können an den Gewebeschnitten haften bleiben und Autofluoreszenz verursachen. Halten Sie die Proben während des gesamten Experiments von Licht fern.
- Antigen-Rückgewinnung
- Legen Sie die Objektträger in eine Färbe- und Reparaturbox und füllen Sie sie mit PH6- oder PH9-Pufferarbeitslösung, decken Sie sie mit dem Deckel ab und erhitzen Sie sie 2 x 8 Minuten lang in der Mikrowelle bei 100 % Leistung.
Anmerkungen: Geben Sie während des Erhitzungsvorgangs doppelt destilliertes Wasser in die Reparaturbox, um eine übermäßige Verdunstung zu verhindern, die zum Austrocknen der Scheiben führen kann. - Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie fortfahren (30-60 min).
- Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 min mit doppelt destilliertem Wasser. Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um den Gewebeabschnitt auf dem Objektträger zu umschließen.
- Legen Sie die Objektträger in eine Färbe- und Reparaturbox und füllen Sie sie mit PH6- oder PH9-Pufferarbeitslösung, decken Sie sie mit dem Deckel ab und erhitzen Sie sie 2 x 8 Minuten lang in der Mikrowelle bei 100 % Leistung.
- Blockierend
- Tauchen Sie die Gewebeschnitte in Waschpuffer, bedecken Sie sie mit Blockierungslösung und inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
- Inkubation von primären Antikörpern
- Entfernen Sie die Blockierungslösung von den Objektträgern und bedecken Sie die Gewebeschnitte mit der primären Antikörper-Arbeitslösung. Inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei 37 °C im Inkubator oder über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank.
HINWEIS: Lassen Sie die Objektträger nicht austrocknen.
- Entfernen Sie die Blockierungslösung von den Objektträgern und bedecken Sie die Gewebeschnitte mit der primären Antikörper-Arbeitslösung. Inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei 37 °C im Inkubator oder über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank.
- Einführung von Polymer HRP
- Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang in Waschpuffer-Arbeitslösung. Geben Sie Polymer HRP direkt tropfenweise in die Gewebeschnitte und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Im Kühlschrank aufbewahrte Objektträger vor dem Waschen ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren, um den primären Antikörper zu entfernen.
- Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang in Waschpuffer-Arbeitslösung. Geben Sie Polymer HRP direkt tropfenweise in die Gewebeschnitte und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Erzeugung von Tyramin-Signalverstärkung (TSA)
- Waschen Sie den Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung, geben Sie die Fluorophor-Arbeitslösung direkt tropfenweise in die Gewebeschnitte und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung.
- Spezielles Verfahren für Fluorophor 780
HINWEIS: Fluorophor 780 ist schwach und wird routinemäßig an letzter Stelle im Farbanpassungsschema des gesamten Experiments platziert. Fluorophor 780 wird normalerweise nicht in diesem Versuchsprotokoll verwendet, aber aufgrund seiner Spezifität werden seine experimentellen Schritte aufgeführt.- Einführung von TSA-DIG
- Waschen Sie den Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung, geben Sie die TSA-Drg-Arbeitslösung tropfenweise in die Gewebeschnitte und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Mikrowellen-Behandlung
- Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung.
- Legen Sie die Objektträger in eine Färbe- und Reparaturbox, füllen Sie sie mit Reparaturlösung, decken Sie sie mit dem Deckel ab und erhitzen Sie sie 2 x 8 Minuten lang in der Mikrowelle bei 100 % Leistung. Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie fortfahren (30-60 min).
- Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser.
- Signalerzeugung mit Fluorophor 780
- Tauchen Sie die Schnitte in Waschpuffer, bedecken Sie sie mit der Arbeitslösung Fluorophor 780 und inkubieren Sie die Objektträger 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.
- Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung.
HINWEIS: Führen Sie nach diesem Schritt keine Mikrowellenbehandlung durch.
- Verwenden Sie Fluorophor 780 als letzten Schritt des gesamten Arbeitsablaufs und färben Sie die Kerne dann direkt mit der DAPI-Arbeitslösung.
HINWEIS: Überspringen Sie Schritt 3.7, wenn Sie kein Fluorophor 780 verwenden.
- Einführung von TSA-DIG
- Mikrowellen-Behandlung
HINWEIS: Dieser Mikrowellenschritt entfernt den primär-sekundären HRP-Komplex und setzt Antigene erneut frei, was die Einführung des nächsten primären Antikörpers ermöglicht.- Legen Sie die Objektträger in eine Färbe- und Reparaturbox, füllen Sie sie mit PH6- oder PH9-Pufferarbeitslösung, decken Sie sie mit dem Deckel ab und erhitzen Sie sie 2 x 8 Minuten lang in der Mikrowelle bei 100 % Leistung.
- Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie fortfahren (30-60 min). Waschen Sie die Objektträger 3 x 1 min mit doppelt destilliertem Wasser.
- Tauchen Sie die Objektträger 2 Minuten lang in die Arbeitslösung des Waschpuffers. Führen Sie die nächste Antikörperinkubation durch.
- Nächste Antikörper-Inkubation
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.8 (außer Schritt 3.7).
- Zellkernfärbung und Gewebeversiegelung
- Decken Sie die Gewebeschnitte mit der DAPI-Arbeitslösung ab und inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser.
- Entfernen Sie Wassertropfen von den Objektträgern, fügen Sie jedem Objektträger 10-20 μl Anti-Fluoreszenz-Quencher hinzu und versiegeln Sie die Objektträger mit einem Mikroskop-Deckglas.
- Lagern Sie die fertigen Objektträger bei 4 °C lichtgeschützt länger als 1 Monat.
HINWEIS: Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden.
4. Richten Sie die Negativkontrolle ein
- Verarbeiten Sie die Negativkontrollobjektträger wie die gewebehaltigen Objektträger, jedoch ohne Zusatz von Reagenzien wie Primärantikörpern, Sekundärantikörpern, TSA-Reagenzien und DAPI, die zum Entfernen der Gewebeautofluoreszenz beim Scannen des Films verwendet werden.
5. Vollautomatisches Scannen von Gewebeobjektträgern
HINWEIS: Das für die spektrale Bildgebung verwendete Gerät ist ein vollautomatischer multispektraler Gewebequantifizierungsanalysator, und die Bildgebung und Analysevisualisierung von 5-Farben-Objektträgern kann mit dem referenzierten System durchgeführt werden (siehe Materialtabelle). Das System verwendet multispektrale Bildgebung zur quantitativen Entmischung mehrerer Fluorophore und Gewebeautofluoreszenz.
- Stellen Sie die Belichtungszeit und das Scanprogramm für jeden Fluoreszenzkanal manuell ein und bestätigen Sie, dass das Gerät die vollautomatische Belichtung und das Scannen der Gewebeobjektträger abgeschlossen hat.
HINWEIS: Die Objektträgeroberfläche muss sauber und frei von Wasserfilm sein. Seien Sie vorsichtig mit der Menge an Versiegelung: Zu viel führt dazu, dass das Deckglas verrutscht und das Instrument einen Fehler meldet.
6. Analyse der Fluoreszenz
- Doppelklicken Sie auf die Software (siehe Materialtabelle), ziehen Sie die mehrfarbige Fluoreszenzbilddatei aus dem Originalscan in die Software und stellen Sie den Bildtyp auf Fluoreszenz ein.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Helligkeit und Kontrast und überprüfen Sie die Kanäle auf dem Bedienfeld. Klicken Sie nach außen und dann auf den Kanal , um den gewünschten Fluoreszenzkanal auszuwählen. Ziehen Sie die Min-Anzeige und die Max-Anzeige , um die Helligkeit und den Kontrast der einzelnen Kanäle anzupassen.
- Bestimmen Sie nach der Analyse die zu speichernde Ansicht, klicken Sie auf Folienübersicht anzeigen und Cursorposition anzeigen , um diese beiden Inhalte zu entfernen, behalten Sie die Maßstabsleiste bei und klicken Sie auf Datei | Snapshot exportieren | Aktueller Viewer-Inhalt zum Exportieren einer PNG-Datei.
HINWEIS: Jeder Fluoreszenzkanal und eine zusammengeführte Abbildung müssen für zukünftige Analysen exportiert werden. - Zur weiteren Analyse der Zielzellpositivität verwenden Sie die Zellidentifikations- und Segmentierungssoftware21 (siehe Materialtabelle).
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Representative Results
Wir haben das Matching-Schema von CD8-Primärantikörpern und Fluorophoren optimiert. Beide Sätze von Fluoreszenzergebnissen entsprachen genau den gleichen Antikörper-Inkubationsbedingungen in der Versuchsgruppe, mit Ausnahme der Änderung des Antikörper-angepassten Fluorophors. Wie in Abbildung 2 gezeigt, gab es einen signifikanten Unterschied in der Kanalanpassung von CD8+ T-Zellen mit Fluorophor 480 und Fluorophor 690. Der Kanal mit Fluorophor 690 zeigt einen extrem starken fluoreszierenden Hintergrund - der große Bereich der roten unregelmäßigen Fluoreszenz innerhalb des gelben Kreises zeigt Farbe, was eine große Interferenz bei der Lokalisierungsanalyse von CD8+ T-Zellen verursacht (Abbildung 2C,D). Der Kanal mit Fluorophor 480 zeigt jedoch eine sehr spezifische CD8-Zellmembran-Positivität und keinen fluoreszierenden Hintergrund. Somit zeigen die gelben Kreise eine sehr klare positive Zellmembran (Abbildung 2A), was die Bedeutung des Antikörper- und Fluoreszenzkanal-Matchings in diesem Protokoll vollständig veranschaulicht.
Die Verteilung von Makrophagen und zytotoxischen T-Zellen wurde in nicht-kleinzelligen Lungenplattenepithelkarzinomgeweben untersucht und die Expression des charakteristischen Proteins HMGCS1 in Tumorzellen und Immunzellen nachgewiesen. Wie in Abbildung 3 gezeigt, wurden die Bilder von QuPath 0.3.2 abgeleitet. Das mIHC-Panel bestand aus den Fluorophoren 480, 520, 620, 690 und DAPI, und die entsprechenden Antikörpermarker waren CK5/6, ein Marker für Plattenepithelkarzinomzellen der Lunge; CD8, ein Marker für T-Zellen; CD68, ein Marker für Makrophagen; und HMGCS1, das spezifisch für plasmapositive Tumorzellen ist. Makrophagen und CD8+ T-Zellen zeigten eine starke Infiltration und waren um und innerhalb der Plattenepithelkarzinomherde verteilt, während HMGCS1 im Plattenepithelkarzinomzellplasma weit verbreitet war und eine starke Tumorzellpositivität zeigte.
Abbildung 1: Der Arbeitsablauf der immunhistochemischen Multiplex-Färbung für FFPE-Gewebe. Abkürzung: FFPE = formalin-fixiert und paraffineingebettet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Optimierung der Matching-Protokolle für CD8 und Fluorophore. Es gab einen signifikanten Unterschied in der Kanalanpassung von CD8+ T-Zellen mit Fluorophor 480 und Fluorophor 690. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Multiplex-immunhistochemische Färbung beim Plattenepithelkarzinom der Lunge. Die Verteilung von Makrophagen und zytotoxischen T-Zellen in nicht-kleinzelligen Lungenplattenepithelkarzinomgeweben und die Expression des charakteristischen Proteins HMGCS1 in Tumorzellen und Immunzellen. CK5/6 ist ein Marker für Plattenepithelkarzinomzellen der Lunge; CD8 ist ein Marker für T-Zellen; CD68 ist ein Marker für Makrophagen; und HMGCS1 ist spezifisch für Tumorzellplasma-positive Zellen. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Multiplex-Immunhistochemie-Technik | Traditionelle Immunfluoreszenztechnik | ||||
| Anzahl der molekularen Targets | Unbegrenzt (bis zu 9 Arten von Färbungen gleichzeitig, einschließlich DAPI) | Allgemeine Kennzeichnung 3-4 Arten (einschließlich DAPI) | |||
| Bilderfassung | Hohe Färbeauflösung und Färbespezifität, Signalverstärkung, starke Signalintensität, längere Quenching-Zeit, kein Hintergrundeffekt und viel höheres Signal-Rausch-Verhältnis an jeder Zielstelle. | Schwache Helligkeit, einfaches Abschrecken, gegenseitige Beeinflussung verschiedener Antikörper, hoher Hintergrund | |||
| Datenanalyse | Flächenspezifität, Zellsegmentierung, einzelzellige räumliche Informationen | Beobachtung mit bloßem Auge und genaue Quantifizierung durch ImageJ | |||
Tabelle 1: Vergleich zwischen der Opal-Multimarkierungs-Immunfluoreszenztechnologie und der herkömmlichen Immunfluoreszenztechnologie.
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Discussion
mIHC ist eine unverzichtbare experimentelle Technik im Bereich der wissenschaftlichen Forschung für die quantitative und räumliche Analyse mehrerer Proteinmarker auf Einzelzellebene in einem einzigen Gewebeschnitt, die intuitive und genaue Daten für die Untersuchung der Krankheitspathologie liefert, indem sie sich auf die detaillierte Gewebestruktur und die zellulären Interaktionen im Kontext des ursprünglichen Gewebes konzentriert. Die weit verbreitete Einführung der mIHC-Technologie erfordert optimierte und effektive Versuchsprotokolle. Um die Probleme anzugehen, die in den Experimenten auftreten können, stellen wir die folgenden Überlegungen und Lösungen vor.
Erstens wird nach dem Prinzip des Matchings von Antigen und Fluorescein-markiertem Antikörper in Mehrfarbenexperimenten schwach exprimiertes Antigen mit stark fluoresceinmarkiertem Antikörper und stark exprimiertes Antigen mit schwach fluoresceinmarkiertem Antikörper abgeglichen. In Kombination mit den Ergebnissen von IHC-Experimenten mit einzelnen Antikörper-markierten Antigenen wird die Expressionsintensität des Zielproteins bestimmt und das Matching von Antikörper und Fluorescein angepasst, wodurch schließlich das Matching-Schema von Antikörper und Fluorescein bestimmt wird, das in Mehrfarbenmarkierungsexperimenten erforderlich ist. Benachbarte Fluoreszenzkanäle mit unterschiedlichen Proteinexpressionsniveaus des Antikörpers können das Problem der benachbarten Fluoreszenzkanal-Stringfarbe lösen. Zweitens wurden die Softwareeinstellungen für die Detektion von Fluoreszenzsignalen mit dem Bildgebungssystem von Akoya Biosciences für die Bildgebung gefärbter Objektträger festgelegt, und die Fluoreszenzerfassungsparameter wurden mit der multispektralen Scansoftware Phenochart 1.0 eingestellt, die die Überprüfung der Fluoreszenzsignalbalance22 ermöglicht. Es wird empfohlen, dass die Belichtungszeit für einen einzelnen Fluoreszenzkanal innerhalb von 100 ms liegt und homogener und für mehrere Fluoreszenzkanäle nicht höher als 200 ms sein sollte. Die Fluoreszenzparameter werden basierend auf den IHC-optimierten Antikörper-Inkubationsbedingungen eingestellt.
Drittens kann das Problem der Autofluoreszenz analysiert werden, indem ein Blindregler eingestellt wird, kombiniert mit der charakteristischen spektralen Detektion der multispektralen Bildgebung. Dadurch können die gemischten Farbsignale identifiziert und bei formalinfixierten paraffineingebetteten Proben das Signal-Rausch-Verhältnis der Bilder um etwa eine Größenordnung verbessert werden, indem die Autofluoreszenz des Gewebesentfernt wird 23. Viertens sollten Antikörper mit schlechter Gewebespezifität mit tierischem Nichtimmunserum als Blockierungslösung verwendet werden, um gewebeunspezifische Chromogenität zu behandeln, die normalerweise vor dem primären Antikörper zugegeben wird. Die ausgewählte Serumspezies ist im Allgemeinen die gleiche wie die Quelle der sekundären Antikörperspezies, was die unspezifische Chromogenität verringern kann. Fünftens wird empfohlen, Negativkontrollen und Positivkontrollen als experimentelle Qualitätskontrollen einzurichten. Die Positivkontrolle hat die Aufgabe, die Qualität der Reagenzien zu überprüfen, und die Negativkontrolle hat die doppelte Funktion, die Qualität der experimentellen Verfahren zu überprüfen und die Autofluoreszenz beim Scannen von Objektträgern zu entfernen. Die Kombination kann verwendet werden, um die Genauigkeit jedes Experiments sicherzustellen. Sechstens ist der Schritt zum Waschen von Objektträgern während des gesamten Experiments sehr wichtig. Die im Protokoll vorbereiteten Reagenzien sollten verwendet werden, und die Waschzeit sollte verwendet werden, um die Reagenzien bei jedem Schritt von den Objektträgern abzuwaschen, um eine Beeinträchtigung der Markierung im nächsten Schritt zu vermeiden.
Wenn die Spezifität eines einzelnen Fluoreszenzkanals schlecht ist, was zu unspezifischer Positivität und Fluoreszenzübersprechen führt, müssen Benutzer das IHC-Ergebnis des entsprechenden Antikörpers überprüfen, das positive Ergebnis bestätigen und dann einen Wechsel des entsprechenden Fluorophors in Betracht ziehen. Wenn ein einzelnes positives Fluoreszenzergebnis zu schwach oder zu stark ist, ist es wichtig, die Filmscanparameter auf die empfohlene Fluorophor-Belichtungszeit von 10-150 ms zurückzusetzen.
Diese Mehrfachmarkierungsmethode ist derzeit auf paraffineingebettete Gewebeproben beschränkt, da der Proteinmarkierungsprozess mehrere antigene thermische Reparaturen erfordert, bei denen das Gewebe fixiert werden muss, um einen Bruch zu verhindern. Gefrorene Schnitte von frischem Gewebe halten den durch thermische Reparatur verursachten Schäden nicht stand, und große Mengen an Gewebe gehen verloren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese In-situ-Markierungsmethode mit mehreren Antigenen weniger zeitaufwändig ist, mit einer Prozesszeit von weniger als 3 Stunden für die Markierung einzelner Antikörper. Es kombiniert die Vorteile eines multispektralen Bildgebungssystems und einer professionellen Pathologieanalysesoftware, um das mIHC-Versuchsprotokoll in Bezug auf individuelle Proteinmarkierungsbedingungen und experimentelle Gruppen- und Fluoreszenzkanaleinstellungen zu optimieren.
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Disclosures
Alle Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten den Mitgliedern des Clinical Pathology Research Institute West China Hospital danken, die technische Leitlinien für eine qualitativ hochwertige Multiplex-Immunfluoreszenz und IHC-Verarbeitung beigesteuert haben. Dieses Protokoll wurde von der National Natural Science Foundation of China (82200078) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-CD8 | Abcam | ab237709 | Primary antibody, 1/100, PH9 |
| Anti-CD68 | Abcam | ab955 | Primary antibody, 1/300, PH9 |
| Anti-CK5/6 | Millipore | MAB1620 | Primary antibody, 1/150, PH9 |
| Anti-HMGCS1 | GeneTex | GTX112346 | Primary antibody, 1/300, PH6 |
| Animal nonimmune serum | MXB Biotechnologies | SP KIT-B3 | Antigen blocking |
| Fluormount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Anti-fluorescent burst |
| Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit | Akoya | NEL861001KT | Opal mIHC Staining |
| Wash Buffer | Dako | K8000/K8002/K8007/K8023 | Washing the tissues slides |
| Software | |||
| HALO | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| inForm | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| PerkinElmer Vectra | multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides. | ||
| QuPath 0.3.2 | intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment. |
References
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