Summary
פרוטוקול ניסיוני זה מתאר ומייעל שיטת צביעה של אימונוהיסטוכימיה מרובת אולמים (IHC), בעיקר על ידי אופטימיזציה של תנאי דגירה של נוגדנים חד-ערוציים והתאמת ההגדרות של נוגדנים ותעלות לפתרון בעיות של אוטופלואורסנציה ותקשורת צולבת ערוצים ברקמות סרטן ריאות ממוצא קליני.
Abstract
סרטן הריאה הוא הגורם המוביל לתחלואה ותמותה מגידולים ממאירים בכל רחבי העולם, והמיקרו-סביבה המורכבת של הגידול נחשבת לסיבת המוות המובילה בקרב חולי סרטן ריאה. המורכבות של המיקרו-סביבה של הגידול דורשת שיטות יעילות להבנת יחסי תא-תא ברקמות הגידול. טכניקת האימונוהיסטוכימיה המרובבת (mIHC) הפכה לכלי מפתח להסקת הקשר בין ביטוי חלבונים במעלה ובמורד הזרם של מסלולי איתות ברקמות הגידול לבין פיתוח אבחנות קליניות ותוכניות טיפול. mIHC היא שיטת צביעה אימונופלואורסצנטית מרובת תוויות המבוססת על טכנולוגיית הגברת אות טיראמין (TSA), שיכולה לזהות בו זמנית מולקולות מטרה מרובות על אותה דגימת מקטע רקמה כדי להשיג ביטוי משותף של חלבונים שונים וניתוח לוקליזציה משותפת. בפרוטוקול ניסויי זה, קטעי רקמה משובצים בפרפין של קרצינומה קשקשית ריאתית ממקור קליני היו נתונים לצביעה אימונוהיסטוכימית מרובה. על ידי אופטימיזציה של פרוטוקול הניסוי, הושגה צביעה אימונוהיסטוכימית מרובת משתתפים של תאי מטרה וחלבונים מסומנים, ופתר את בעיית האוטופלואורסצנטיות ושיחות הערוץ ברקמות הריאה. בנוסף, צביעה אימונוהיסטוכימית מרובת משתתפים נמצאת בשימוש נרחב בתיקוף ניסיוני של ריצוף הקשור לגידול, בתפוקה גבוהה, כולל ריצוף תא יחיד, פרוטאומיקה וריצוף חלל רקמות, ומספק תוצאות אימות פתולוגיות אינטואיטיביות וחזותיות.
Introduction
הגברת אות טיראמין (TSA), שיש לה היסטוריה של יותר מ -20 שנה, היא קבוצה של טכניקות בדיקה המשתמשות בפרוקסידז חזרת (HRP) לתיוג צפיפות גבוהה באתרו של אנטיגני מטרה ומיושמת באופן נרחב בבדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (ELISAs), הכלאה באתרו (ISH), אימונוהיסטוכימיה (IHC) וטכניקות אחרות לזיהוי אנטיגנים ביולוגיים, שיפור משמעותי ברגישות האות שזוהה1. צביעה פוליכרומטית אופל המבוססת על טכנולוגיית TSA פותחה לאחרונה ונמצאת בשימוש נרחב במספר מחקרים 2,3,4,5. צביעת אימונופלואורסנציה מסורתית (IF) מספקת לחוקרים כלי קל לזיהוי והשוואה של התפלגות החלבונים בתאים וברקמות של אורגניזמים שונים במודל. הוא מבוסס על קשירה ספציפית לנוגדנים/אנטיגן וכולל גישות ישירות ועקיפות6. הצמדה חיסונית ישירה כוללת שימוש בנוגדן ראשוני מצומד פלואורופור כנגד האנטיגן המעניין, המאפשר זיהוי פלואורסצנטי ישיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הגישה החיסונית העקיפה כוללת יישום של נוגדן משני מצומד פלואורופור כנגד נוגדן ראשוני לא מצומד 6,7.
שיטות מסורתיות של צביעה אימונופלואורסצנטית עם תווית אחת יכולות להכתים רק אנטיגן אחד, שניים או במקרים מסוימים שלושה אנטיגנים ברקמות, מה שמהווה מגבלה משמעותית בכריית המידע העשיר הכלול בקטעי רקמות. הפרשנות של תוצאות כמותיות תלויה לעתים קרובות בתצפית חזותית וכימות מדויק על ידי תוכנות הדמיה, כגון ImageJ. ישנן מגבלות טכניות, כגון הגבלת מיני נוגדנים, אותות תווית פלואורסצנטיים חלשים וחפיפת צבע פלואורסצנטי (טבלה 1). טכניקת אופל מולטיפלקס IHC (mIHC) מבוססת על נגזרת TSA, המאפשרת צביעת מולטיפלקס ותיוג דיפרנציאלי של יותר מ 7-9 אנטיגנים על אותו חתך רקמה, ללא הגבלה על מקור הנוגדן הראשוני, אך דורשת ספציפיות גבוהה של הנוגדן המתאים כנגד האנטיגן. הליך הצביעה דומה לזה של צביעה אימונופלואורסצנטית רגילה, למעט שני הבדלים: כל סבב צביעה כרוך בשימוש בנוגדן אחד בלבד ונוסף שלב פליטת נוגדנים. נוגדנים הקשורים לאנטיגן על ידי קשרים לא קוולנטיים ניתנים להסרה על ידי הדבקה במיקרוגל, אך האות הפלואורסצנטי TSA הקשור לפני השטח של האנטיגן על ידי קשרים קוולנטיים נשמר.
מולקולות טיראמין פעיל (T) המסומנות בצבע מועשרות מאוד באנטיגן המטרה, ומאפשרות הגברה יעילה של האות הפלואורסצנטי. זה מאפשר תיוג ישיר של האנטיגן ללא הפרעה של נוגדנים, ואז ניתן להשיג תיוג צבעוני לאחר מחזורי צביעה מרובים 8,9,10 (איור 1). למרות שטכנולוגיה זו מייצרת תמונות אמינות ומדויקות לחקר מחלות, יצירת אסטרטגיית צביעה פלואורסצנטית פלואורסצנטית שימושית (mfIHC) יכולה להיות גוזלת זמן ומדויקת בשל הצורך באופטימיזציה ועיצוב נרחבים. לכן, פרוטוקול פאנל מולטיפלקס זה עבר אופטימיזציה במכתים IHC אוטומטי עם זמן צביעה קצר יותר מזה של הפרוטוקול הידני. גישה זו יכולה להיות מיושמת ומותאמת ישירות על ידי כל חוקר למחקרים אימונו-אונקולוגיים על דגימות רקמה קבועות פורמלין ומשובצות פרפין (FFPE)אנושיות 11. יתר על כן, השיטות להכנת שקופיות, אופטימיזציה של נוגדנים ועיצוב מולטיפלקס יסייעו בהשגת תמונות חזקות המייצגות אינטראקציות תאיות מדויקות באתרן ולקיצור תקופת האופטימיזציה לניתוח ידני12.
mfIHC כולל בעיקר רכישת תמונות וניתוח נתונים. במונחים של רכישת תמונה, דגימות מוכתמות מורכבות עם תוויות מרובות צבעים צריכות להיות מזוהות עם ציוד הדמיה ספקטרלי מקצועי כדי לזהות את אותות הצבע המעורבים השונים ולקבל תמונות אות לרעש גבוהות ללא הפרעה של אוטופלואורסצנטיות רקמות. הציוד הנוכחי לדימות ספקטרלי כולל בעיקר מיקרוסקופים קונפוקליים ספקטרליים ומערכות דימות רקמות מולטיספקטרליות. מערכת דימות רקמות מולטיספקטרלית היא מערכת הדמיה מקצועית המיועדת לניתוח כמותי של קטעי רקמות, והמאפיין החשוב ביותר שלה הוא רכישת מידע ספקטרלי תמונה, המספק הן מבנה מורפולוגי והן מידע מיפוי אופטי של דגימות רקמה ביולוגית13,14. כל פיקסל בתמונה הספקטרלית מכיל עקומה ספקטרלית שלמה, ולכל צבע (כולל אוטופלואורסצנציה) יש את הספקטרום האופייני המתאים לו, המאפשר הקלטה מלאה וזיהוי מדויק של אותות מעורבים וחופפים מרובי תוויות.
במונחים של ניתוח נתונים, דגימות מסומנות צבעוניות הן מורכבות ביותר בשל המבנה המורפולוגי והתאים המרכיבים של דגימות הרקמה. תוכנה רגילה אינה יכולה לזהות באופן אוטומטי סוגי רקמות שונים. לפיכך, תוכנה חכמה לניתוח רקמות כמותי משמשת לניתוח כמותי של ביטוי אנטיגן באזורים ספציפיים 15,16,17,18.
מעל לכל, צביעה אימונופלואורסצנטית מרובת תוויות המשולבת עם הדמיה מולטיספקטרלית וטכנולוגיית ניתוח פתולוגיה כמותית היא בעלת יתרונות של מספר רב של מטרות זיהוי, צביעה יעילה וניתוח מדויק, ולכן היא יכולה לשפר באופן משמעותי את דיוק הניתוח ההיסטומורפולוגי, לחשוף את הקשר המרחבי בין חלבונים ברזולוציה ברמת התא, ולסייע בכריית מידע עשיר ואמין יותר מדגימות חתך רקמות19 (טבלה 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול מאושר על ידי הנחיות ועדת האתיקה של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן, סין. דגימות רקמת סרטן הריאה התקבלו במהלך ניתוח במרכז לסרטן ריאות בבית החולים מערב סין, והתקבלה הסכמה מדעת מכל חולה.
1. הכנת מקטע רקמות
- הכנת FFPE
- לטבול רקמות קליניות בתמיסת פורמלין ניטרלית במשך יותר מ-72 שעות.
- השלם את תהליך התייבשות הרקמות באמצעות קסילן ותמיסות אלכוהוליות מדורגות20.
- בצע הטבעה ידנית של פרפין וחתך רקמות בעובי חתך של 4 מיקרומטר. השתמש בשקופיות מיקרוסקופ הידבקות כדי להבטיח שפרוסות הרקמה לא ינשרו.
- אופים את המגלשות בתנור בטמפרטורה של 18 מעלות למשך שעתיים כדי להבטיח שהרקמה והמגלשות יבשות. יש לאחסן בקופסת שקופיות בטמפרטורת החדר.
- טיפול מקדים למקטע רקמות
- יש לטפל במגלשות הרקמה בתנור בטמפרטורה של 65°C למשך 5 דקות, ולאחר מכן לטבול ברצף בתמיסות קסילן למשך 2 x 15 דקות, תמיסות אתנול נטול מים למשך 2 x 15 דקות, תמיסת אתנול 90% למשך 10 דקות, תמיסת אתנול 85% למשך 10 דקות, תמיסת אתנול 80% למשך 10 דקות ותמיסת אתנול 75% למשך 10 דקות, לאחר מכן יש לשטוף את המגלשות במים מעוקרים למשך 3X1 דקה.
הערה: טכניקה ניסיונית זו יכולה לשמש רק עבור רקמת FFPE, לא עבור רקמה קפואה או טרייה, מכיוון שתהליך תיקון האנטיגן בטמפרטורה גבוהה גורם לרקמה ליפול מהמגלשה.
- יש לטפל במגלשות הרקמה בתנור בטמפרטורה של 65°C למשך 5 דקות, ולאחר מכן לטבול ברצף בתמיסות קסילן למשך 2 x 15 דקות, תמיסות אתנול נטול מים למשך 2 x 15 דקות, תמיסת אתנול 90% למשך 10 דקות, תמיסת אתנול 85% למשך 10 דקות, תמיסת אתנול 80% למשך 10 דקות ותמיסת אתנול 75% למשך 10 דקות, לאחר מכן יש לשטוף את המגלשות במים מעוקרים למשך 3X1 דקה.
2. אופטימיזציה של נוגדן ראשוני
הערה: ניסויים קונבנציונליים של IHC שימשו לקביעת תנאי הדגירה של נוגדנים בודדים, בעיקר כולל ריכוז נוגדנים ותנאי תיקון אנטיגן. עיין בתנאים במדריך הוראות הנוגדנים.
- יש להשתמש בריכוז נוגדנים מעט גבוה יותר מטווח הריכוז המומלץ ומערכי הביניים.
- מטב את שגרות חיץ שליפת האנטיגן PH6 ו- PH9 בהתאם למיקום ביטוי החלבון. השתמש ב- PH9 עבור חלבונים המבוטאים בגרעין והשתמש בשגרה (PH6 או PH9) עבור חלבונים אחרים.
3. שיטת צביעת mIHC
הערה: צביעת אופל mIHC היא אחת משיטות mIHC הזמינות. בפרוטוקול ניסיוני זה של 5 צבעים, מכיוון שכל דגימת רקמה צריכה להיות מוכתמת בארבעה נוגדנים, ארבע דגירות נוגדנים ראשוניות, דגירות נוגדנים משניות והדגרות כרומוגניות של הגברת אותות TSA, כמו גם חמישה שחזורי אנטיגן. לבסוף, 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) צביעה ואיטום סוכן מתפרץ אנטי פלואורסצנטי מבוצעים.
- הכנת מגיב עיקרי
הערה: קבע את כמות המגיב שיש להוסיף בהתאם לגודל שקופיות הרקמה. השתמש בנפח מספיק כדי לכסות לחלוטין את קטע הרקמה (בדרך כלל, 50-150 μL לכל שקופית). פתרונות העבודה הנדרשים לניסוי נערכים כדלקמן:- פתרון עבודה למאגר שטיפה: יש לדלל את מאגר הכביסה פי 20 בשעה 1:20 במים מזוקקים כפול, ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- פתרון עבודה במאגר PH6: יש לדלל חיץ PH6 100x ביחס של 1:100 במים מזוקקים פעמיים. יש להכין לפני השימוש ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- פתרון עבודה במאגר PH9: יש לדלל חיץ PH9 של 50x ביחס של 1:50 במים מזוקקים כפול. יש להכין לפני השימוש ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- HRP פולימרי: הכינו תמיסה מוכנה לשימוש זו רק עבור נוגדנים ראשוניים ממקור ארנב ועכבר.
- פתרון עבודה פלואורופור: הרכבה מחדש של כל אבקת פלואורופור (למעט פלואורופור 780) ב-75 מיקרוליטר של DMSO. לפני כל הליך, לדלל את הפלואורופור ב 1x מדלל הגברה ב 1:100. השליכו כל חלק שאינו בשימוש בתמיסת העבודה של הפלואורופור.
- פתרון עבודה Fluorophore 780: לבנות מחדש TSA-DIG ב 75 μL של DMSO ואת אבקת פלואורופור 780 ב 300 μL של מים מזוקקים כפול. לפני ההליך, לדלל TSA-DIG במדלל הגברה 1x ב 1:100, ולדלל פלואורופור 780 עם דילול Ab ב 1:25.
- פתרון עבודה DAPI: דלל את תמיסת DAPI בשעה 1:50 במים מזוקקים פעמיים או PBS. יש להכין לפני השימוש ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך לא יותר מ-48 שעות.
הערה. שטפו את המגלשות רק עם מים מזוקקים פעמיים ופתרון עבודה טרי של חיץ כביסה במהלך ניסוי זה של צביעת פלואורסצנטיות מרובת תוויות. אסור שחלקי רקמות יבואו במגע עם מי ברז; מזהמים במי הברז עלולים להיצמד לחלקי הרקמה ולגרום לפלואורסצנטיות עצמית. יש להרחיק את הדגימות מאור במהלך הניסוי.
- שליפת אנטיגן
- הניחו את המגלשות בקופסת צביעה ותיקון ומלאו אותה בתמיסת חיץ PH6 או PH9, כסו במכסה וחממו במיקרוגל למשך 2X8 דקות בעוצמה של 100%.
הערה: הוסיפו מים מזוקקים פעמיים לקופסת התיקון במהלך תהליך החימום כדי למנוע אידוי יתר שעלול לגרום לפרוסות להתייבש. - מניחים למגלשות להתקרר בטמפרטורת החדר לפני שממשיכים (30-60 דקות).
- שטפו את המגלשות 3X2 דקות במים מזוקקים כפול. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי להקיף את מקטע הרקמה בשקופית.
- הניחו את המגלשות בקופסת צביעה ותיקון ומלאו אותה בתמיסת חיץ PH6 או PH9, כסו במכסה וחממו במיקרוגל למשך 2X8 דקות בעוצמה של 100%.
- חסימת
- יש לטבול את חלקי הרקמה במאגר הכביסה, לכסות בתמיסת חסימה ולדגור על שקופיות בתא לח בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- דגירה ראשונית של נוגדנים
- הסר את תמיסת החסימה מהשקופיות וכסה את חלקי הרקמה בתמיסת העבודה העיקרית של הנוגדנים. לדגור את המגלשות בתא לח במשך 1 שעות ב 37 ° C באינקובטור או לילה ב 4 ° C במקרר.
הערה: אל תתנו לשקופיות להתייבש.
- הסר את תמיסת החסימה מהשקופיות וכסה את חלקי הרקמה בתמיסת העבודה העיקרית של הנוגדנים. לדגור את המגלשות בתא לח במשך 1 שעות ב 37 ° C באינקובטור או לילה ב 4 ° C במקרר.
- מבוא ל-HRP פולימרי
- שטפו את המגלשות בתמיסת עבודה של מאגר כביסה למשך 3 x 2 דקות. הוסיפו את HRP הפולימרי ישירות למקטעי הרקמה ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: עבור שקופיות המאוחסנות במקרר, יש לשמור אותן בטמפרטורת החדר למשך כ-30 דקות לפני הכביסה כדי להסיר את הנוגדן הראשי.
- שטפו את המגלשות בתמיסת עבודה של מאגר כביסה למשך 3 x 2 דקות. הוסיפו את HRP הפולימרי ישירות למקטעי הרקמה ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- דור הגברת אות טיראמין (TSA)
- שטפו את המגלשה עם תמיסת עבודה של חיץ כביסה למשך 3 x 2 דקות, הוסיפו תמיסת עבודה פלואורופורית ישירות לחלקי הרקמות, ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטף את המגלשה עם פתרון עבודה של מאגר כביסה למשך 3 x 2 דקות.
- הליך מיוחד עבור fluorophore 780
הערה: פלואורופור 780 חלש ובדרך כלל ממוקם אחרון בסכמת התאמת הצבעים של הניסוי כולו. פלואורופור 780 אינו משמש בדרך כלל בפרוטוקול ניסיוני זה, אך בגלל הספציפיות שלו, השלבים הניסיוניים שלו מפורטים.- מבוא של TSA-DIG
- שטפו את המגלשה עם תמיסת עבודה של חיץ שטיפה למשך 3 x 2 דקות, הוסיפו פתרון עבודה TSA-Drg טיפה לחלקי הרקמות, ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- טיפול במיקרוגל
- שטפו את המגלשות עם פתרון עבודה של מאגר כביסה למשך 3 x 2 דקות.
- מניחים את המגלשות בקופסת צביעה ותיקונים, ממלאים אותה בתמיסת תיקון, מכסים במכסה ומחממים במיקרוגל למשך 2X8 דקות בעוצמה של 100%. מניחים למגלשות להתקרר בטמפרטורת החדר לפני שממשיכים (30-60 דקות).
- שטפו את המגלשות במשך 3X2 דקות במים מזוקקים כפול.
- יצירת אותות Fluorophore 780
- טבלו את החלקים במאגר הכביסה, כסו בתמיסת עבודה פלואורופור 780 ודגרו על המגלשות בתא לח למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- שטפו את המגלשות עם פתרון עבודה של מאגר כביסה למשך 3 x 2 דקות.
הערה: אין לבצע טיפול מיקרוגל לאחר שלב זה.
- השתמש בפלואורופור 780 כשלב האחרון של זרימת העבודה כולה ולאחר מכן הכתים גרעינים ישירות באמצעות פתרון העבודה DAPI.
הערה: דלג על שלב 3.7 אם אינך משתמש בפלואורופור 780.
- מבוא של TSA-DIG
- טיפול במיקרוגל
הערה: שלב מיקרוגל זה מסיר את קומפלקס HRP הראשוני-משני וחושף מחדש אנטיגנים, מה שמאפשר החדרת הנוגדן הראשוני הבא.- הניחו את המגלשות בקופסת צביעה ותיקונים, מלאו אותה בתמיסת חיץ PH6 או PH9, כסו במכסה וחממו במיקרוגל למשך 2X8 דקות בעוצמה של 100%.
- מניחים למגלשות להתקרר בטמפרטורת החדר לפני שממשיכים (30-60 דקות). שטפו את המגלשות 3X1 דקות במים מזוקקים כפול.
- טבלו שקופיות בפתרון עבודה של מאגר כביסה למשך 2 דקות. בצע את דגירה נוגדנים הבא.
- דגירה הבאה של נוגדנים
- חזור על שלבים 3.2-3.8 (למעט שלב 3.7).
- צביעה גרעינית של תאים ואיטום רקמות
- כסו את חלקי הרקמה בתמיסת העבודה DAPI ודגרו על המגלשות בתא לח למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את המגלשות במשך 3X2 דקות במים מזוקקים כפול.
- הסר טיפות מים מהמגלשות, הוסף 10-20 מיקרוליטר של מרווה נגד פלואורסצנטיות לכל שקופית, ואטם את המגלשות עם זכוכית כיסוי במיקרוסקופ.
- אחסן את השקופיות המוגמרות ב 4 ° C, מוגן מפני אור, במשך יותר מ 1 חודש.
הערה: יש להקפיד להימנע מבועות אוויר.
4. הגדר את השליטה השלילית
- עבד את שקופיות הבקרה השליליות כמו שקופיות המכילות רקמות, אך ללא תוספת של ריאגנטים כגון נוגדנים ראשוניים, נוגדנים משניים, ריאגנטים TSA ו- DAPI, המשמשים להסרת אוטופלואורסצנטיות של רקמות בעת סריקת סרט הצילום.
5. סריקה אוטומטית לחלוטין של שקופיות רקמות
הערה: הציוד המשמש להדמיה ספקטרלית הוא מנתח כימות רקמות מולטיספקטרלי אוטומטי לחלוטין, וניתן לבצע הדמיה וניתוח של שקופיות ב-5 צבעים באמצעות המערכת המוזכרת (ראה טבלת חומרים). המערכת משתמשת בהדמיה מולטיספקטרלית לפירוק כמותי של פלואורופורים מרובים ואוטופלואורסצנטיות רקמות.
- הגדר ידנית את זמן החשיפה ואת תוכנית הסריקה עבור כל ערוץ פלואורסצנטי וודא שהמכשיר השלים את החשיפה והסריקה האוטומטיות לחלוטין של שקופיות הרקמה.
הערה: משטח המגלשה חייב להיות נקי ונקי מסרט מים. היזהר עם כמות האיטום: יותר מדי יגרום לכיסוי להחליק ולמכשיר לדווח על שגיאה.
6. ניתוח פלואורסצנטיות
- לחץ פעמיים על התוכנה (ראה טבלת חומרים), גרור את קובץ התמונה הפלואורסצנטי הרב-צבעוני שהתקבל מהסריקה המקורית לתוך התוכנה והגדר את סוג התמונה לפלואורסצנטיות.
- לחצו על הלחצן 'בהירות וניגודיות ' ובדקו את הערוצים בחלונית. לחץ בחוץ ולאחר מכן על הערוץ כדי לבחור את ערוץ הפלואורסצנטיות של עניין. גרור את תצוגת המינימום ואת התצוגה המרבית כדי לכוונן את הבהירות והניגודיות של כל ערוץ.
- לאחר הניתוח, קבע את התצוגה שיש לשמור, לחץ על הצג סקירה כללית של שקופיות והצג מיקום סמן כדי להסיר שני תוכן אלה, שמור על סרגל קנה המידה ולחץ על קובץ | ייצוא תמונת מצב | תוכן מציג נוכחי לייצוא קובץ png.
הערה: יש לייצא כל ערוץ פלואורסצנטי ונתון ממוזג לצורך ניתוח עתידי. - לניתוח נוסף של חיוביות תאי המטרה, השתמש בתוכנה לזיהוי ופילוח תאים21 (ראה טבלת חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביצענו אופטימיזציה של ערכת ההתאמה של נוגדנים ראשוניים CD8 ופלואורופורים. שתי קבוצות התוצאות הפלואורסצנטיות התאימו בדיוק לאותם תנאי דגירה של נוגדנים בקבוצת הניסוי, למעט השינוי בפלואורופור תואם הנוגדנים. כפי שניתן לראות באיור 2, היה הבדל משמעותי בהתאמת התעלה של תאי T CD8+ עם פלואורופור 480 ופלואורופור 690. התעלה עם פלואורופור 690 מראה רקע פלואורסצנטי חזק מאוד – השטח הגדול של פלואורסצנטיות אדומה לא סדירה בתוך העיגול הצהוב מראה צבע, מה שגורם להפרעה רבה בניתוח הלוקליזציה של תאי CD8+ T (איור 2C,D). עם זאת, הערוץ עם פלואורופור 480 מראה חיוביות ספציפית מאוד של קרום התא CD8 וללא רקע פלואורסצנטי. לכן, העיגולים הצהובים מראים קרום תא חיובי ברור מאוד (איור 2A), מה שממחיש באופן מלא את החשיבות של התאמת נוגדנים ותעלות פלואורסצנטיות בפרוטוקול הזה.
התפלגות המקרופאגים ותאי T ציטוטוקסיים נבדקה ברקמות קרצינומה קשקשית ריאתית של תאים שאינם קטנים, ואומת ביטוי החלבון האופייני HMGCS1 בתאי הגידול ובתאי מערכת החיסון. כפי שניתן לראות באיור 3, התמונות נגזרו מ-QuPath 0.3.2. פאנל ה-mIHC היה פלואורופורים 480, 520, 620, 690 ו-DAPI, וסמני הנוגדנים המתאימים היו CK5/6, סמן לתאי קרצינומה קשקשית ריאתית; CD8, סמן לתאי T; CD68, סמן למקרופאגים; ו-HMGCS1, שהוא ספציפי לתאי גידול חיוביים לפלזמה. מקרופאגים ותאי CD8+ T הראו חדירה כבדה ופוזרו סביב ובתוך מוקדי קרצינומה קשקשית, בעוד HMGCS1 התבטא באופן נרחב בפלזמה של תאי קרצינומה קשקשית, והראה חיוביות חזקה של תאי הגידול.
איור 1: תהליך העבודה של צביעה אימונוהיסטוכימית מרובת מרבבים עבור רקמת FFPE. קיצור: FFPE = פורמלין-קבוע ופרפין מוטבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אופטימיזציה של פרוטוקולי ההתאמה עבור CD8 ופלואורופורים. היה הבדל משמעותי בהתאמת התעלה של תאי CD8+ T עם פלואורופור 480 ופלואורופור 690. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: צביעה אימונוהיסטוכימית מרובת משתתפים בקרצינומה קשקשית ריאתית. התפלגות המקרופאגים ותאי T ציטוטוקסיים ברקמות קרצינומה קשקשית ריאתית של תאים שאינם קטנים וביטוי החלבון האופייני HMGCS1 בתאי הגידול ובתאי מערכת החיסון. CK5/6 הוא סמן לתאי קרצינומה קשקשית ריאתית; CD8 הוא סמן לתאי T; CD68 הוא סמן למקרופאגים; ו- HMGCS1 הוא ספציפי לתאים חיוביים לפלזמה של תאי גידול. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| טכניקת אימונוהיסטוכימיה מולטיפלקס | טכניקת אימונופלואורסנציה מסורתית | ||||
| מספר מטרות מולקולריות | ללא הגבלה (עד 9 סוגי צביעה בבת אחת, כולל DAPI) | סימון כללי 3-4 סוגים (כולל DAPI) | |||
| רכישת תמונות | רזולוציית צביעה גבוהה וספציפיות צביעה, הגברת איתות, עוצמת אות חזקה, זמן מרווה ארוך יותר, ללא אפקט רקע ויחס אות לרעש גבוה בהרבה בכל אתר מטרה. | בהירות חלשה, מרווה קלה, השפעה הדדית בין נוגדנים שונים, רקע גבוה | |||
| ניתוח נתונים | ספציפיות שטח, פילוח תאים, מידע מרחבי של תא בודד | תצפית בעין בלתי וכימות מדויק על ידי ImageJ | |||
טבלה 1: השוואה בין טכנולוגיית אימונופלואורסנציה מרובת תיוגים של אופל לבין טכנולוגיית אימונופלואורסנציה מסורתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mIHC היא טכניקה ניסיונית חיונית בתחום המחקר המדעי לניתוח כמותי ומרחבי של סמנים חלבוניים מרובים ברמת התא הבודד בקטע רקמה יחיד, המספק נתונים אינטואיטיביים ומדויקים לחקר פתולוגיה של מחלות על ידי התמקדות במבנה הרקמה המפורט ובאינטראקציות תאיות בהקשר של הרקמה המקורית. האימוץ הנרחב של טכנולוגיית mIHC ידרוש פרוטוקולים ניסיוניים אופטימליים ויעילים. כדי להתמודד עם הבעיות שעלולות להתעורר בניסויים, אנו מציגים את השיקולים והפתרונות הבאים.
ראשית, על פי העיקרון של התאמת אנטיגן ונוגדן עם תווית פלואורסצאין בניסויים מרובי צבעים, אנטיגן מבוטא חלש מותאם לנוגדן עם תווית פלואורסצאין חזקה, ואנטיגן מבוטא חזק מותאם לנוגדן עם תווית פלואורסצאין חלשה. בשילוב עם תוצאות ניסויי IHC של אנטיגנים המסומנים בנוגדנים בודדים, נקבעת עוצמת הביטוי של חלבון המטרה, והתאמת הנוגדנים והפלואורסצאין מותאמת, ולבסוף קובעת את סכימת ההתאמה של נוגדנים ופלואורסצאין הנדרשת בניסויי תיוג רב-צבעוניים. תעלות פלואורסצנטיות סמוכות עם רמות ביטוי חלבון שונות של הנוגדן יכולות לפתור את הבעיה של צבע מחרוזת תעלה פלואורסצנטית סמוכה. שנית, הגדרות התוכנה לזיהוי אותות פלואורסצנטיים נקבעו באמצעות מערכת ההדמיה Akoya Biosciences להדמיית שקופיות מוכתמות, ופרמטרי רכישת הפלואורסצנטיות נקבעו באמצעות תוכנת הסריקה המולטיספקטרלית Phenochart 1.0, המאפשרת לבדוק את מאזן האות הפלואורסצנטי22. מומלץ שזמן החשיפה יהיה בטווח של 100 מילישניות עבור תעלה פלואורסצנטית אחת וצריך להיות הומוגני יותר ולא גבוה מ-200 מילישניות עבור תעלות פלואורסצנטיות מרובות. הפרמטרים הפלואורסצנטיים מותאמים על בסיס תנאי הדגירה של הנוגדנים הממוטבים על ידי IHC.
שלישית, ניתן לנתח את בעיית האוטופלואורסצנטיות על ידי הגדרת בקרה ריקה, בשילוב עם זיהוי ספקטרלי אופייני של הדמיה מולטיספקטרלית. פעולה זו יכולה לזהות את אותות הצבע המעורבים, ועבור דגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין, לשפר את יחס האות לרעש של התמונות בסדר גודל בקירוב על ידי הסרת אוטופלואורסצנטיותרקמה 23. רביעית, כדי לטפל בכרומוגניות לא ספציפית של רקמות, יש להשתמש בנוגדנים עם ספציפיות רקמה ירודה עם סרום לא חיסוני של בעלי חיים כתמיסה חוסמת, שבדרך כלל מוסיפים לפני הנוגדן הראשוני. מיני הסרום שנבחרו זהים בדרך כלל למקור של מיני הנוגדנים המשניים, אשר יכולים להפחית כרומוגניות לא ספציפית. חמישית, מומלץ להגדיר בקרה שלילית ובקרות חיוביות כבקרות איכות ניסיוניות. הבקרה החיובית יש את התפקיד של בדיקת איכות ריאגנטים, ואת הבקרה השלילית יש את הפונקציה הכפולה של אימות איכות של הליכים ניסיוניים והסרת autofluorescence בעת סריקת שקופיות. ניתן להשתמש בשילוב כדי להבטיח את הדיוק של כל ניסוי. שישית, שלב שטיפת המגלשה חשוב מאוד לאורך כל הניסוי. יש להשתמש בריאגנטים שהוכנו בפרוטוקול, ולהשתמש בזמן השטיפה כדי לשטוף את הריאגנטים מהשקופיות בכל שלב כדי למנוע הפרעה לתיוג בשלב הבא.
כאשר הספציפיות של ערוץ פלואורסצנטי יחיד היא גרועה, וכתוצאה מכך חיוביות לא ספציפית ו crosstalk פלואורסצנטי, המשתמשים חייבים לבדוק את תוצאת IHC של הנוגדן המתאים, לאשר את התוצאה החיובית, ולאחר מכן, לשקול לשנות את פלואורופור הרלוונטי. אם תוצאת פלואורסצנטיות חיובית אחת חלשה מדי או חזקה מדי, חשוב לאפס את פרמטרי סריקת הסרט לזמן החשיפה המומלץ לפלואורופור של 10-150 אלפיות השנייה.
שיטת תיוג מרובה זו מוגבלת כיום לדגימות רקמה משובצות פרפין, מכיוון שתהליך תיוג החלבונים דורש תיקונים תרמיים אנטיגניים מרובים, המחייבים קיבוע הרקמה כדי למנוע שבירה. חלקים קפואים של רקמה טרייה לא יעמדו בנזק שנגרם כתוצאה מתיקון תרמי, וכמויות גדולות של רקמה יאבדו.
לסיכום, שיטת תיוג אנטיגן באתרו זו גוזלת פחות זמן, עם זמן תהליך תיוג נוגדנים יחיד של פחות מ -3 שעות. הוא משלב את היתרונות של מערכת הדמיה מולטיספקטרלית ותוכנת ניתוח פתולוגיה מקצועית כדי לייעל את פרוטוקול הניסוי mIHC במונחים של תנאי תיוג חלבונים בודדים והגדרות קבוצת ניסוי וערוץ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לחברי מכון המחקר לפתולוגיה קלינית בית החולים מערב סין, שתרמו הדרכה טכנית לאימונופלואורסנציה מולטיפלקס איכותית ועיבוד IHC. פרוטוקול זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82200078).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-CD8 | Abcam | ab237709 | Primary antibody, 1/100, PH9 |
| Anti-CD68 | Abcam | ab955 | Primary antibody, 1/300, PH9 |
| Anti-CK5/6 | Millipore | MAB1620 | Primary antibody, 1/150, PH9 |
| Anti-HMGCS1 | GeneTex | GTX112346 | Primary antibody, 1/300, PH6 |
| Animal nonimmune serum | MXB Biotechnologies | SP KIT-B3 | Antigen blocking |
| Fluormount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Anti-fluorescent burst |
| Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit | Akoya | NEL861001KT | Opal mIHC Staining |
| Wash Buffer | Dako | K8000/K8002/K8007/K8023 | Washing the tissues slides |
| Software | |||
| HALO | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| inForm | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| PerkinElmer Vectra | multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides. | ||
| QuPath 0.3.2 | intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment. |
References
- Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).
- Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).
- Nghiem, P. T., et al. PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).
- Zaretsky, J. M., et al. Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma. The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).
- Wang, C., et al. The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289 (2022).
- Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count. Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).
- Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development. Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Meany, D. L., Hackler, L. Jr, Zhang, H., Chan, D. W. Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).
- Surace, M., et al. Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390 (2019).
- Lazarus, J., et al. Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915 (2019).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Mansfield, J. R. Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated QUantitative Analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. QuPath: The global impact of an open source digital pathology system. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 852-859 (2021).
- Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 16878 (2017).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System. Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).
- Wilson, C. M., et al. Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data. Cancers. 13 (12), 3031 (2021).
- Mori, H., et al. Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).
- Mansfield, J. R. Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets. Methods. 52 (4), 271-280 (2010).
